CTP-OD-HA融合肽抑制BCR-ABL同源寡聚化逆轉CML細胞惡性表型.pdf

1、慢性粒細胞白血病（chronic myeloid leukemia，CML）以具有強烈酪氨酸激酶活性的BCR-ABL融合蛋白的持續(xù)表達為重要特征。BCR-ABL癌蛋白能激活多條癌性信號通路，通過抑制細胞分化和凋亡，促進增殖和異常黏附而導致細胞惡性轉化，在CML的發(fā)生發(fā)展過程中起到關鍵性作用。針對BCR-ABL酪氨酸激酶活性的特異性小分子抑制劑如格列衛(wèi)、達沙替尼和尼洛替尼等的臨床應用使CML治療獲得了很大進展，但最終因不能清除CML惡性克

2、隆而導致部分患者出現耐藥或復發(fā)，因此，急需進一步探討CML治療新靶點。 BCR-ABL融合蛋白N端寡聚化區(qū)域（oligomerization domain，OD域）所介導的BCR-ABL同源寡聚化是BCR-ABL自身磷酸化導致分子構型改變，并最終異常激活Abl酪氨酸激酶活性的關鍵因素。我們推測：通過轉導外源性OD域蛋白入CML細胞后干擾BCR-ABL寡聚化來抑制BCR-ABL酪氨酸激酶活化可成為CML治療的新切入點。但由于生物

3、大分子無法自動穿越細胞膜和需要精確定位到特定亞細胞池中才能發(fā)揮功能等原因而使蛋白類藥物為基礎的細胞治療策略受到極大限制。 胞漿轉導肽（Cytoplasmic transduction peptide，CTP）是一種新近報道的能攜帶蛋白類大分子穿越細胞膜并定位于細胞漿中的新型轉導肽，非常適合于作為攜帶胞漿蛋白治療肽的穿膜系統(tǒng)。鑒于本研究中設計的OD域短肽擬在胞漿區(qū)發(fā)揮競爭性抑制胞漿蛋白BCR-ABL自身寡聚化的作用，CTP可成為合

4、適的OD域轉運載體。 本實驗在構建、表達并純化具有胞漿定位活性的CTP-OD-HA融合肽（為便于后期的免疫學檢測而引入HA標簽）的基礎上，以含有BCR-ABL融合基因的K562、KU812、BP210和DP210等各種CML細胞株為體外模型，以BP210-Babl/C CML小鼠為體內模型，探討外源性CTP-OD-HA融合蛋白作用CML細胞及模型動物后是否能通過抑制BCR-ABL同源寡聚化進而抑制其酪氨酸激酶活性而對CML細胞生

5、長、增殖和凋亡產生影響，旨在探索一種新的CML分子靶向治療策略。采用的主要實驗方法如下： 1.CTP-OD-HA融合蛋白的克隆構建、原核表達、純化及生物學活性分析：通過次序嚴密的分步克隆，分別將OD、HA和CIP基因片段順次克隆入原核表達載體pET32a（+）中。進行酶切與測序鑒定后，將構建正確的pCTP-OD-HA重組質粒轉化大腸桿菌BL-21（DE3）菌株，在IPTG誘導下表達CTP-OD-HA融合蛋白，表達產物用SDS-P

6、AGE和western blot進行鑒定；采用組氨酸親和層析法純化目的蛋白；經脫鹽定量后進行腸激酶切割、回收、FITC標記，熒光顯微鏡檢測FITC-CTP-OD-HA融合蛋白在CML細胞株中的轉導活性；免疫細胞化學染色和激光共聚焦顯微鏡觀察融合蛋白轉導入CML細胞后的亞細胞定位情況；Western blot進一步分析CTP-OD-HA在各種CML細胞內的轉導活性；以期為進一步探討CTP-OD-HA融合蛋白治療肽對CML的治療作用奠定實驗

7、基礎。 2.觀察CTP-OD-HA融合蛋白轉導在CML細胞株中的特異性抑增殖、促凋亡等生物學效應，并對其作用機制進行探討。 3.構建BCR-AI3L轉化的BP210造血細胞株在等基因Balb/C小鼠體內定殖的CML動物模型，并對其血液學、臟器浸潤特征以及建?？芍貜托缘确矫孢M行鑒定和驗證后，觀察CTP-OD-HA融合蛋白預轉導對CML模型動物的保護作用。 通過以上實驗，獲得如下主要結果和結論： 1.CTP-

8、OD-HA融合蛋白在37℃、1mM IPTG誘導4h的條件下獲得高效、可溶性表達；經Ni-NTA親和純化獲得了高純度CTP-OD-HA融合蛋白；經脫鹽、腸激酶切割和FITC標記后證實了CTP-OD-HA融合蛋白在CML細胞中的高效轉導效率；免疫細胞化學染色和激光共聚焦顯微鏡觀察證實了CTP-OD-HA明顯的胞漿定位偏性；Western blot實驗進一步證實了CTP-OD-HA在各種CML模型細胞中的高轉導活性。由此可見，CTP-OD-

9、HA融合基因能在PET表達系統(tǒng)中以可溶性形式高效表達，重組蛋白CTP-OD-HA具有良好的生物學活性，為下一步研究CTP-OD-HA的生物學功能奠定了基礎。 2.純化的CTP-OD-HA融合蛋白轉導后在各種CML細胞株中表現出BCR-ABL特異性增殖抑制和凋亡誘導效應；進一步的機制研究證實：CTP-OD-HA轉導入CML細胞后能通過競爭性結合BCR-ABL癌蛋白而抑制其自身寡聚化和后續(xù)酪氨酸磷酸化，阻斷癌性酪氨酸激酶信號通路，并