神經(jīng)元限制性沉默因子參與大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)樣細(xì)胞體外分化過程的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[目的]：
　　 1、研究成纖維生長因子bFGF，堿性生長因子EGF聯(lián)合全反式維甲酸誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)樣細(xì)胞體外分化過程中的神經(jīng)特異性標(biāo)志的表達(dá)變化。
　　 2、分析神經(jīng)元限制性沉默因子(NRSF/REST)以及NRSF調(diào)控的基因在成纖維生長因子bFGF，堿性生長因子EGF聯(lián)合全反式維甲酸誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)向神經(jīng)元分化過程中表達(dá)的變化。
　　 3、探討神經(jīng)元限制性沉默因子(NRSF/

2、REST)在大鼠MSCs向神經(jīng)元分化的作用及MSCs向神經(jīng)元分化的進(jìn)程。
　　 [方法]
　　 1.通過貼壁法分離培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并經(jīng)形態(tài)學(xué)、細(xì)胞表面標(biāo)記和分化潛能鑒定。
　　 2.取P5代細(xì)胞種植于6孔板。用10ng/ml bFGF預(yù)誘導(dǎo)24小時(shí)后，采用成纖維生長因子bFGF，堿性生長因子EGF聯(lián)合全反式維甲酸的方案進(jìn)行誘導(dǎo)，分別于干預(yù)前與干預(yù)后1，3，5，7，9天，采用免疫細(xì)胞熒光化學(xué)檢測神經(jīng)元

3、特異性稀醇化酶NSE，神經(jīng)微管蛋白β-tubulinⅢ及膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志GFAP的陽性率及實(shí)時(shí)定量PCR染料法NSE、β-tubulinⅢ和GFAP的mRNA的表達(dá)水平。
　　 3.采用實(shí)時(shí)定量PCR染料法，對(duì)照組不加誘導(dǎo)劑，分別于干預(yù)前與干預(yù)后1，3，5，7，9天檢測神經(jīng)元限制性沉默因子(NSRF/REST)及其相關(guān)基因β-TrCP、SCG10、BDNF的mRNA的相對(duì)表達(dá)量。
　　 [結(jié)果]
　　 1.通過貼壁法

4、分離培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，5代后細(xì)胞呈均一梭形漩渦樣生長，流式細(xì)胞術(shù)檢測間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原CD34-，CD45-，CD90+。具有向脂肪細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞分化的多向潛能。
　　 2.應(yīng)用成纖維生長因子bFGF，堿性生長因子EGF聯(lián)合全反式維甲酸的誘導(dǎo)方案可以將MSCs誘導(dǎo)分化成神經(jīng)元樣細(xì)胞，誘導(dǎo)后的細(xì)胞神經(jīng)元標(biāo)記物神經(jīng)元特異性烯醇化酶NSE，神經(jīng)微管蛋白β-tubulinⅢ及膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志GFAP呈陽性。神經(jīng)元特異性稀醇化酶

5、NSE.，神經(jīng)微管蛋白β-tubulinⅢ的表達(dá)與時(shí)間呈趁勢正相關(guān)，第7天表達(dá)最高，誘導(dǎo)第9天表達(dá)下降；膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志GFAP于誘導(dǎo)第9天表達(dá)明顯增加。
　　 3.神經(jīng)元限制性沉默因子(NSRF/REST)于誘導(dǎo)第5天表達(dá)顯著下降，β-TrCP于誘導(dǎo)第5天表達(dá)增高，NRSF的靶基因SCG10、BDNF表達(dá)有不同程度的上調(diào)。
　　 [結(jié)論]
　　 1.貼壁法可以大量培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　 2.采用細(xì)胞因