巴馬香豬肝硬化形成過程中細菌移位的初步研究.pdf

1、1.研究背景及目的
　　 肝硬化(cirrhosis of liver)是一種以肝組織彌漫性纖維化、假小葉和再生結(jié)節(jié)形成為特征的慢性肝病，也是我國常見疾病和主要死亡病因之一。臨床上有多系統(tǒng)受累，以肝功能損害和門靜脈高壓為主要表現(xiàn)，肝硬化常伴隨腸源性感染，研究表明其感染的主要的來源是腸道細菌，以腸桿科細菌為主。本研究基于臨床采樣難，在治療過程中使用抗生素等藥物的原因基礎(chǔ)之上，采用經(jīng)典的四氯化碳加飼喂酒精的方法制備肝硬化動物模型，更

2、好地模擬人患肝硬化，以期研究肝硬化形成過程中細菌移位情況，建立移位菌種庫，為進一步研究臨床肝硬化、腸源性感染以及肝移植患者的治療和預(yù)后提供基礎(chǔ)參考數(shù)據(jù)。
　　 CCl4誘導(dǎo)的肝病模型多用來研究肝纖維化的細胞及分子機制、血清學(xué)標志物、組織病理及抗纖維化物質(zhì)的藥效評價。目前CCl4誘導(dǎo)的小型豬肝病模型用來研究動物腸道微生態(tài)失衡與感染性疾病之間關(guān)系的文獻還未見報到。本研究旨在探討在肝硬化形成過程中細菌移位情況。為進一步探討細菌移位發(fā)生

3、機制，尋找臨床細菌移位防治措施，對改善肝硬化病人生活質(zhì)量有重要的現(xiàn)實意義。
　　 2.研究內(nèi)容和結(jié)果
　　 2.1研究內(nèi)容
　　 2.1.1巴馬香豬肝硬化模型的制備方法
　　 3月齡巴馬香豬16頭(由第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部實驗動物學(xué)教研室提供)，模型組6頭雄性，4頭雌性，共10頭；對照組5頭雄性，1頭雌性，共6頭，均未閹割，體重為12.0±1.9 kg。飼喂玉米面，適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，模型組自由飲用10％的酒精

4、，腹腔注射40％CCl4橄欖油溶液，注射劑量按每千克體重0.25 ml溶液，每4天1次。
　　 2.1.2肝硬化形成過程中移位細菌的鑒定方法
　　 經(jīng)過肝穿病理切片初步判斷已有肝硬化形成的巴馬香豬，于無菌條件下，剖腹取內(nèi)臟器官，于超凈臺研磨成組織漿液，接種于總菌(BHI)固體培養(yǎng)基，進行普通細菌培養(yǎng)，37℃條件下培養(yǎng)24-48h。基于16S rRNA基因的可變區(qū)---V3區(qū)設(shè)計引物，然后通過PCR-DGGE初步篩選帶型一

5、致的，將其對應(yīng)的PCR產(chǎn)物進行核苷酸測序，從而鑒定移位細菌。
　　 2.2研究結(jié)果
　　 2.2.1巴馬香豬肝硬化模型
　　 歷時6個月成功誘導(dǎo)巴馬香豬肝硬化模型6頭，成模率達60％，死亡率20％。
　　 2.2.2移位細菌菌種庫的構(gòu)建
　　 所得序列通過GenBank(網(wǎng)址：http：//www.Ncbi.him.nih.Gov)進行同源性比較。結(jié)果顯示肝硬化模型組移位細菌主要是以腸桿菌科的腸桿

6、菌屬、埃希氏菌屬、愛德華氏菌屬為主，其次是革蘭氏陽性兼性厭氧的葡萄球菌屬、棒桿菌屬、腸球菌屬、鏈球菌屬，如：金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、解沒食子酸鹽鏈球菌，以及嚴格厭氧的革蘭氏陰性巨大球菌屬的解酪蛋白巨大球菌、棒狀桿菌等厭氧菌。移位到腸系膜淋巴結(jié)的數(shù)量最多，多達8340CFU/g，其次是肝臟，再次是腎臟，移位細菌最少的就是肺部。正常對照組肝、脾、腸系膜淋巴結(jié)均無細菌生長。
　　 3.結(jié)論
　　 3.1成功獲得了小型豬肝硬化

7、動物模型，證明了肝硬化形成過程中伴隨腸道細菌移位的發(fā)生，并成功構(gòu)建了移位菌菌種庫。
　　 3.2移位細菌核酸序列在GenBank中比對結(jié)果顯示革蘭氏陰性菌占47.1％，革蘭氏陽性菌占58.3％；83.3％是兼性厭氧菌，16.7％是需氧菌。其中大腸埃希氏菌占30.1％，葡萄球菌屬占25.0％，棒狀桿菌屬占8.33％，巨大球菌屬占8.33％等等。
　　 3.3從移位部位來看，移位到血液、肝、脾、肺、腎、腸系膜淋巴結(jié)的細菌數(shù)量