ART對人早孕期胎兒印記基因表達和修飾的影響及其對出生兒血脂代謝改變及相關機制研究.pdf

1、隨著以體外受精-胚胎移植（in-vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）和卵細胞漿內單精子注射（intracytoplasm sperm injection，ICSI）為代表的現代輔助生殖技術(assisted reproductive techniques，ART)不斷推廣應用，全世界ART出生兒已經超過數百萬。已有不少的流行病學研究顯示，除低出生體重兒發(fā)生增多、早產和新生兒出生缺

2、陷率升高之外，ART子代還增高了BW綜合癥(Beckwith-Wiedemann syndrome)和Angelman綜合癥(Angelman syndrome)等印記紊亂疾病的發(fā)生風險。許多動物實驗亦證明ART過程可對出生子代的H19、 Ascl2、Peg3、Xist等印記基因的表觀遺傳學修飾和表達產生影響。但受材料獲取的限制，人類的相關分子機理研究主要局限在分娩后的臍血和胎盤組織和ART兒童的外周血，另有少部分利用的是廢棄或多余的I

3、VF著床前胚胎。從具有向機體各類組織細胞分化潛能的全能性卵裂球或內細胞團細胞，到著床后分化生長的三胚層細胞，到各組織器官細胞的分化形成、直至新生兒的出生，人類細胞的基因組印記從修飾、調控、到表達發(fā)生了復雜的分子生物學變化，人類對ART宮內早期生長階段的胎兒組織有關基因表達和修飾影響研究的極度匱乏，是我們目前了解ART過程影響出生子代基因組表觀遺傳學健康發(fā)生發(fā)展過程的難點之一。
　　早在1995年英國學者Barker提出了著名的“胎

4、兒源性疾病學說”，認為胎兒期宮內發(fā)育不良或生長過度導致的出生兒體重改變，與成年后肥胖、糖尿病、高血壓等疾病聯(lián)系緊密。其中胎兒宮內營養(yǎng)改變，導致成年后脂肪代謝異常、胰島素抵抗、動脈血壓增高和腎臟結構改變已被多個研究證實。2010年，Motrenko等進一步提出“疾病胚胎起源學說”，認為胚胎形成時期外界不良因素可增加成年后慢性疾病的發(fā)生率，其中不良環(huán)境暴露引起的配子、胚胎和胎兒組織表觀遺傳學修飾改變，被認為是重要的發(fā)病機理之一。ART對配子

5、成熟、精卵結合和胚胎生長過程的干擾，ART兒出生體重和表觀遺傳學修飾改變的證據，均與“胚胎-胎兒源性疾病”的發(fā)病機理相類似，提示ART子代存在因胚胎/胎兒因素，導致成年后諸如心血管疾病一類疾病發(fā)生風險上升的可能?，F已有證據表明，人類ART出生兒存在血壓增加、空腹血糖和血脂水平升高的趨勢。我們研究小組先行開展ART小鼠模型研究顯示，老年（1.5周歲）ART小鼠存在血壓、心率、血脂、糖耐量和胰島素水平的顯著性改變，其發(fā)生和發(fā)展與脂代謝重要調

6、節(jié)通路——胰島素誘導基因(insulin-induced gene，INSIG)，SREBP裂解激活蛋白(sterol regulatoryelement-binding protein cleavage-activating protein，SCAP)和類固醇調節(jié)元件結合蛋白(sterol regulatory element-binding protein，SREBP)基因的表達和修飾改變存在聯(lián)系。但迄今為止，人類ART子代有關血脂

7、代謝改變的發(fā)生機理研究仍鮮有報道，有關人ART胎兒、胎盤組織INSIG-SCAP-SREBP通路基因表達和修飾改變的研究仍為空白。
　　2007年Kobayashi等發(fā)現少精子癥患者精子存在印記位點甲基化的異常，男性不育患者的精子會含有表觀遺傳異常的印記基因，并具有將此缺陷遺傳給子孫的風險，且精子質量越差，甲基化印記改變越明顯。后來有學者對絨毛DNA和相對應的精子DNA同時進行檢測，證實了精子細胞攜帶的異常印記可以傳遞到子代絨毛，

8、Kobayashi等的研究進一步發(fā)現，41％的子代DNA甲基化異?？梢栽诟赣H精子中找到相同的異常改變，這也進一步提示印記基因的異常改變有可能源自于父親精子本身的印記異常。ICSI技術是當前男性不育治療最為有效的方法，但其在克服精子數量、活力、形態(tài)異常引起的受精障礙的同時，也跨越了的機體的自然選擇機制，使存在遺傳或表觀遺傳學異常的精子與卵子受精發(fā)育，使出生子代攜有同樣遺傳或表觀遺傳學異常后代的風險升高。故此，研究用于ICSI的少弱精子癥患

9、者的精子DNA的表觀遺傳學修飾改變，有助于人類ICSI后代表觀遺傳學改變的病因學分析。
　　旨在為揭示ART子代印記基因表達修飾改變提供胎兒組織依據，考察ART出生兒血脂代謝改變發(fā)生發(fā)展的分子生物學機制，我們分別收集IVF、ICSI和單純藥物卵巢刺激（control ovarian stimulation，COS）的三胎妊娠胚胎減滅術后的早孕期胎兒組織，以及IVF、ICSI和自然妊娠足月分娩的臍血、胎盤組織，分別進行了ART早孕期

10、胎兒印記基因表達及其差異甲基化區(qū)域修飾變化、ART對出生兒血脂代謝的影響及其機制的研究。并且在發(fā)現ICSI胎兒、胎盤存在血脂代謝調節(jié)基因甲基化修飾顯著性改變的基礎上，進行了ICSI少弱精子癥精子基因DNA甲基化的改變研究。本文從以下及部分進行了闡述。
　　第一部分ART早孕期胎兒印記基因表達及其差異甲基化區(qū)域修飾變化研究。
　　目的:
　　考查生長發(fā)育相關印記基因IGF2, H19和神經系統(tǒng)功能相關印記基因SNRPN,

11、UBE3A在ART早孕期胎兒組織中表達和甲基化狀態(tài)的改變，為揭示ART子代印記基因表達修飾改變提供胎兒組織依據。
　　材料和方法:
　　1分別收集IVF、ICSI和單純藥物卵巢刺激(control ovarian stimulation，COS)的三胎妊娠胚胎減滅術病例，獲取早孕期胎兒組織。
　　2分別提取上述三組患者早孕期胎兒組織的RNA，實時定量RT-PCR(quantitativereal time RT-PCR

12、)檢測各標本印記基因IGF2，H19, SNRPN和UBE3A的mRNA表達水平，比較其在IVF、ICSI和COS三組間的表達差異。
　　3分別提取上述三組患者早孕期胎兒組織的DNA，焦磷酸測序(pyrosequencing)檢測各標本印記基因IGF2, H19, SNRPN和UBE3A印記基因差異甲基化區(qū)域(differentiation methylation regions，DMRs)的甲基化修飾狀態(tài)，比較三組間的甲基化修飾

13、差異。
　　結果:
　　1印記基因的表達水平分析:
　　(1) IVF組的H19表達水平顯著性高于COS組(P＜0.05);但IVF組與ICSI組，ICSI組與COS組間比較，H19表達水平無顯著性差異(P＞0.05);
　　(2) IGF2, SNRPN和UBE3A表達水平在IVF組、ICSI組和COS組間均無顯著性差異(P＞0.05)。
　　2印記基因差異甲基化區(qū)域的甲基化水平
　　(1) IVF

14、組和ICSI組的IGF2 DMR甲基化水平均顯著性高于COS組(P＜0.05);IVF組和ICSI組間差異無顯著性(P＞0.05);
　　(2) IVF組和ICSI組的H19 DMR甲基化水平均顯著性低于COS組(P＜0.05)，IVF和ICSI組間差異無顯著性(P＞0.05);
　　(3) IVF組與ICSI組的SNRPN DMR甲基化水平顯著性高于COS組(P＜0.05)，IVF和ICSI組間無顯著性差異(P＞0.05)

15、;
　　(4) IVF組、ICSI組和COS組的UBE3A DMR的各CpG位點甲基化水平無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　結論:
　　(1)人類ART的精卵體外處理、輔助受精、或受精后胚胎的體外培養(yǎng)可影響早孕期胎兒組織印記基因IGF2, H19和SNRPN DMR的甲基化修飾，但ART過程中最具損傷性的ICSI過程的此類影響不明顯。
　　(2)雖然ART可顯著改變早孕胎兒組織多個印記基因DMR的甲基化修飾，但

16、同時能夠顯著改變基因轉錄水平的只有H19，提示早孕胎兒組織印記基因存在糾正/減低ART引發(fā)的甲基化修飾改變表觀遺傳學效應的調控機制。
　　(3) IVF早孕期胎兒組織中H19呈低甲基化和高表達水平，推測可能和ART所致的低出生體重風險增加有關。
　　第二部分ART對出生兒血脂代謝的影響及其機制研究。
　　目的:
　　考查ART出生兒血脂生化指標的改變;檢測ART早孕期胎兒組織和足月胎盤組織脂代謝重要調節(jié)通路INS

17、IG-SCAP-SREBP的基因表達，及其調節(jié)區(qū)CpG位點的甲基化修飾狀態(tài)，闡明ART出生兒血脂生化指標改變發(fā)生發(fā)展的分子生物學機制。
　　材料和方法:
　　1收集IVF、ICSI和COS三胎妊娠胚胎減滅術后的早孕期胎兒組織，以及IVF、ICSI和自然妊娠(natural conception，NC)足月單胎剖宮產分娩的臍血、胎盤組織及相應的母血。
　　2測定臍血和母親血清甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白的

18、水平，比較他們在IVF、ICSI和自然妊娠三組間的差異。
　　3分別提取上述各組早孕期胎兒組織和足月胎盤組織的RNA，實時定量RT-PCR檢測各標本NSIG1，INSIG2，SCAP，SREBF1，SREBF2的mRNA表達水平，比較其在三組間的表達差異。
　　4選擇mRNA表達有顯著性差異的上述目的基因，應用焦磷酸測序法檢測上述三組早孕期胎兒組織和足月胎盤組織中各基因調節(jié)區(qū)CpG位點的甲基化修飾狀態(tài)，比較其在三組間的甲基化

19、修飾差異。
　　結果:
　　1 ICSI新生兒臍血中甘油三酯水平顯著高于IVF組和NC組(P＜0.05)。
　　2 ICSI組胎兒組織INSIG1 mRNA的水平顯著性高于IVF組和COS組(P＜0.05);和IVF組和自然妊娠組比較，ICSI胎盤組織INSIG1 mRNA的水平高度顯著性升高(P＜0.01)。
　　3與自然妊娠組比較，ICSI胎盤組織SREBF1mRNA的水平顯著性增高(P＜0.05)。

20、　　4無論是胎兒還是胎盤組織，INSIG2,SCAP和SREBF2 mRNA的水平在各組間的表達均無顯著性差異(P＞0.05)。
　　5在胎兒組織中，ICSI組INSIG1的5個CpG位點中有4個位點甲基化水平顯著性低于IVF組和COS組(P＜0.01);IVF組和COS組比較，其甲基化水平無顯著性差異(P＞0.05)。
　　6在胎盤組織中，IVF和ICSI組INSIG1的5個CpG位點甲基化水平均顯著性低于自然妊娠組，其中

21、ICSI組INSIG1呈去甲基化狀態(tài)(P＜0.01);此外在SREBF1的7個CpG位點中，在IVF組有2個，ICSI組有3個位點的甲基化水平顯著性低于自然妊娠組(P＜0.01)。
　　結論:
　　1 ICSI可顯著影響胎兒組織INSIG-SCAP-SREBP通路部分基因的mRNA表達水平，其發(fā)生機理與相應基因啟動子區(qū)CpG位點的甲基化修飾水平改變有關。
　　2 ICSI引起的INSIG-SCAP-SREBP通路部分基

22、因的表達和甲基化修飾改變可在妊娠足月胎盤組織得以進一步的增強，并可能與ICSI新生兒臍血甘油三酯水平的顯著性升高相關。
　　3 IVF亦可導致胎盤組織INSIG-SCAP-SREBP通路部分基因的甲基化修飾改變，但改變程度相對要輕，對相應基因表達及其出生兒血脂代謝的影響不明顯。
　　第三部分少弱精子癥精子中印記及非印記基因DNA甲基化的改變。
　　目的:
　　選取之前發(fā)現在ART胎兒和胎盤組織中存在甲基化修飾改變

23、的印記基因IGF2，H19，SNRPN以及非印記基因INSIG1，SREBF1，考察他們在不同的ART精子中的DNA甲基化狀態(tài)。
　　材料和方法:
　　1收集ART過程中受精完成后剩余的精子，根據術前精子參數分為正常精子組（用于IVF受精）和少弱精子癥組（用于ICSI受精）。
　　2用焦磷酸測序方法檢測精子IGF2，H19，NRPN，INSIG1，SREBF1啟動子區(qū)的甲基化修飾狀態(tài)，比較其在不同ART精子中的甲基化水

24、平是否存在差異。
　　結果:
　　1少弱精子癥精子IGF2, SNRPN和INSIG1各CpG位點的甲基化水平和正常精子相似，差異無顯著性(P＞0.05)。
　　2少弱精子癥精子H19的6個CpG位點中有5個位點甲基化水平顯著低于正常精子（其中CpG3，CpG4:P＜0.01;CpG2，CpG5，CpG6:P＜0.05）。
　　3和正常精子相比，少弱精子癥精子在SREBF1的7個CpG位點中有2個位點（CpG3:

25、P＜0.01和CpG4:P＜0.05）甲基化水平顯著高于正常精子。
　　結論:
　　1少弱精子癥精子中存在印記基因H19和非印記基因SREBF1的甲基化狀態(tài)改變。
　　2印記基因IGF2,SNRPN和非印記基因INSIG1在少弱精子癥精子中未見異常甲基化改變。
　　3 ART尤其是ICSI胎兒和胎盤中印記基因和非印記基因的甲基化修飾改變并非和相應精子中的改變趨勢一致，說明ICSI所引起的子代表觀遺傳改變并非完全來