LDHA在肝癌生長和轉(zhuǎn)移中的作用研究.pdf

1、肝細胞癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)是全球常見第六位腫瘤，并位于腫瘤死因的第三位。我國是原發(fā)性肝癌發(fā)病率較高的國家，每年新發(fā)肝癌的病例數(shù)占世界發(fā)病數(shù)的54％，位于腫瘤死因的第二位。雖然以手術(shù)為主的新型治療手段出現(xiàn)，使得肝癌生存率有了較大的提高，但是超過60％的患者在術(shù)后5年有復(fù)發(fā)可能，較高的復(fù)發(fā)率成為提高患者總體生存的主要障礙。隨著人類基因組學(xué)研究的發(fā)展和基因芯片與蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的產(chǎn)生，高通量基因和蛋白質(zhì)分

2、析成為了可能，對不同肝癌患者的分子特征的認識逐漸深入，基于分子分型基礎(chǔ)之上的臨床病理分子分型和分期系統(tǒng)可使肝癌患者細分為眾多的亞群，在這一基礎(chǔ)之上傳統(tǒng)的手術(shù)、化療、放療、免疫治療、生物治療和新的分子靶向治療等均可按照肝癌患者的個體化特征采用完全個體化的高效的精準治療手段，分子分型可給靶向治療提供更多的靶點。因此，尋找肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物標志物，開展肝癌的新型分子靶向治療，以期達到較高的療效，是當前研究的熱點。
　　惡性腫瘤內(nèi)出現(xiàn)的嚴

3、重的急慢性缺氧，葡萄糖的攝取和無氧糖酵解增加，造成腫瘤細胞惡性轉(zhuǎn)化、侵襲轉(zhuǎn)移和對放化療等治療抵抗，使目前的治療方法難以達到理想的效果，為腫瘤的治療帶來了難題，同時也帶來探索腫瘤治療的切入點。靶向細胞的生化代謝中的糖酵解途徑已逐漸成為癌癥診斷及治療的關(guān)鍵，結(jié)合FDG-PET分子顯像為腫瘤的早期診斷與鑒別診斷、腫瘤內(nèi)缺氧程度的評價、治療前后效果的評估和預(yù)后的判斷開辟新的前景。
　　乳酸脫氫酶(LactateDehydrogenase，

4、LDH)廣泛存在于人體的各個組織中，主要催化糖酵解途徑的終產(chǎn)物丙酮酸和乳酸之間的相互轉(zhuǎn)化。乳酸脫氫酶按照組成亞基(M型、H型)的差異分為5種同工酶。乳酸脫氫酶-A(LactateDehydrogenase-A，LDHA)屬于乳酸脫氫酶家族同工酶之一，全部由M型亞基組成，正常情況下主要分布在肌肉組織中。LDHA主要功能是催化丙酮酸向乳酸轉(zhuǎn)化，同時將NADH轉(zhuǎn)化成NAD+。LDHA基因的突變在人體除可導(dǎo)致運動型肌紅蛋白尿之外，對人體影響不大

5、。近年來研究發(fā)現(xiàn)LDHA在各種實體腫瘤組織中異常表達，且和腫瘤的分化及患者的預(yù)后具有重要的關(guān)系，可能是一個有效的治療靶點。然而，LDHA對肝癌生長的影響，特別是對肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移的影響至今仍不十分清楚。本論文研究不同轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細胞系及人肝癌組織中LDHA表達情況，分析LDHA表達與肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系;采用慢病毒為載體的RNA干擾技術(shù)，研究靶向LDHA基因的治療策略在體內(nèi)外對肝癌細胞生長及侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用，為LDHA作為靶點的肝

6、癌基因治療提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù);利用基因表達譜差異芯片篩選LDHA抑制前后差異表達基因和信號通路，揭示LDHA影響肝癌細胞生長和轉(zhuǎn)移的可能分子機制。
　　第一部分:LDHA在肝癌細胞系及肝癌組織中的表達
　　研究不同轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細胞系及人肝癌組織中LDHA表達情況，分析LDHA表達與肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。分別應(yīng)用Real-timePCR，WesternBlot和生化速率法檢測正常肝細胞系L-02和5種不同轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細胞系H

7、ep3B、HepG2、MHCC97-L、MHCC97-H和HCCLM3細胞LDHA的表達和乳酸脫氫酶活性水平;收集62例原發(fā)性肝癌組織芯片，其中47例無肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，15例有肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，用免疫組織化學(xué)方法檢測LDHA表達情況。Real-timePCR結(jié)果表明，在mRNA水平具有相同遺傳背景的不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細胞系隨侵襲轉(zhuǎn)移潛能增高，LDHA的表達也依次增高，HCCLM3細胞LDHAmRNA表達水平最高，WesternBlot的結(jié)果與Real-

8、timePCR結(jié)果一致。轉(zhuǎn)移潛能高的細胞系細胞胞內(nèi)和細胞培養(yǎng)上清中LDH活性均顯著高于轉(zhuǎn)移潛能較低的細胞系。免疫組化結(jié)果顯示:在肝癌組織中LDHA為胞漿內(nèi)表達，部分有核內(nèi)表達，62例肝癌組織中LDHA表達均為陽性，定量分析結(jié)果表明LDHA的表達水平在有肝內(nèi)轉(zhuǎn)移組顯著強于無肝內(nèi)轉(zhuǎn)移組。以上結(jié)果表明:LDHA在肝癌細胞株和人類原發(fā)性肝細胞癌中高表達，且與肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為有關(guān)，LDHA基因高表達可作為判斷HCC侵襲性和進展的一個

9、重要指標。
　　第二部分:LDHA基因RNAi體外及體內(nèi)實驗研究
　　為進一步研究LDHA對肝癌細胞生長和侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，通過靶向LDHA基因的RNA干擾技術(shù)抑制LDHA表達，觀察高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細胞系HCCLM3生長、侵襲能力以及裸鼠移植瘤腫瘤生長及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的改變，探索靶向LDHARNAi對肝癌生長和轉(zhuǎn)移的治療作用。首先設(shè)計、合成LDHAsiRNA，瞬時轉(zhuǎn)染HCCLM3細胞，Real-timePCR和Weste

10、rnBlot檢測干擾效果。篩選出干擾效率較高靶點用于合成shRNA，構(gòu)建LDHAshRNALenti.干擾質(zhì)粒。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HCCLM3細胞，Real-timePCR，WesternBlot和生化LDH酶活性檢測驗證干擾效果，篩選出干擾效率較高的shRNA重組質(zhì)粒進行后續(xù)體外和體內(nèi)實驗研究。應(yīng)用CCK8、體外侵襲實驗觀察細胞增殖和侵襲能力的改變。裸鼠原位移植瘤實驗觀察LDHA干擾病毒對肝癌生長、轉(zhuǎn)移和裸鼠生存期的影響。結(jié)果表明:針對LD

11、HA基因的LDHAsiRNALenti.重組病毒轉(zhuǎn)染HCCLM3細胞48h后，Real-timePCR和WesternBlot結(jié)果顯示LDHA基因表達水平下降92.8％，蛋白質(zhì)表達水平下降66.8％。在0.4μg/mLpuromycin選擇性培養(yǎng)3周后，得到LDHA低表達的穩(wěn)定克隆細胞株，經(jīng)驗證LDHAmRNA抑制率大于73.3％，蛋白質(zhì)水平和LDH酶活性水平分別下降56.2％和63.2％。體外增殖實驗結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染了LDHAshRNA

12、Lenti.后，HCCLM3細胞增殖能力明顯降低，細胞倍增時間由原來的39.52h增至54.39h，延長了17.8h。侵襲能力明顯降低，與PBS組和對照重組病毒組（ControlshRNALenti.）相比兩者差異有顯著性。裸鼠實驗表明，LDHAshRNALenti.組腫瘤瘤體重(1.43g±0.20g)低于ControlshRNALenti.組(2.19g±0.37g，P＜0.01)和PBS組(2.34g±0.55g，P＜0.01)。

13、ControlshRNALenti.組和PBS組裸鼠發(fā)生肺轉(zhuǎn)移率分別為71.4％和75％，而LDHAshRNALenti.組只有1只(1/10，10％)裸鼠發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，肝癌的肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率顯著下降。LDHAshRNALenti.組荷瘤裸鼠的生存期為141.2d±6.80d，與ControlshRNALenti.組(91.83d±12.87d)和PBS組(95.6d±5.81d)相比差異顯著(P＜0.01)。以上結(jié)果表明:LDHA基因下調(diào)后

14、肝癌細胞侵襲潛能下降，裸鼠肝癌移植瘤生長被抑制，肝內(nèi)和肺轉(zhuǎn)移能力降低，故認為LDHA是治療原發(fā)性肝癌的潛在靶標。靶向肝癌細胞LDHA基因RNA干擾技術(shù)，對肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移抑制作用研究尚未見其他文獻報道。
　　第三部分:LDHA參與肝癌生長和轉(zhuǎn)移的分子機制研究
　　為揭示針對上D尼4基因靶向治療的抗腫瘤作用機制，我們首先應(yīng)用nlumina基因芯片對分別轉(zhuǎn)染LDHAshRNALenti.和ControlshRNALenti.的H

15、CCLM3細胞進行全基因組掃描尋找差異表達基因，應(yīng)用GO對基因進行功能聚類分析。根據(jù)差異基因芯片分析提供的線索，我們分別從葡萄糖代謝，凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移三個方面揭示LDHA參與肝癌生長和轉(zhuǎn)移的分子機制。本研究中，我們共發(fā)現(xiàn)3268個差異表達基因，其中，上調(diào)差異表達基因1663個，下調(diào)差異表達基因1605個。通過GO數(shù)據(jù)庫對基因功能注釋并進行基因功能聚類分析發(fā)現(xiàn)，這些差異表達基因主要參與:能量代謝，黏附與受體相關(guān)生物學(xué)過程，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)

16、，炎癥反應(yīng)，酶相關(guān)生物學(xué)過程，金屬離子結(jié)合，膠原與纖維蛋白相關(guān)生物學(xué)過程，細胞凋亡，血管發(fā)生，細胞增殖分化和發(fā)育，皮膚發(fā)育，免疫應(yīng)答等生物學(xué)過程。
　　根據(jù)差異基因芯片分析提供的線索，我們在體外細胞學(xué)水平，對LDHA影響糖酵解，凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移三個方面作了進一步實驗驗證。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染LDHAshRNALenti.細胞葡萄糖消耗率下降，乳酸生成增加，氧消耗增加，ATP產(chǎn)生下降，提示下調(diào)LDHA可抑制腫瘤細胞的糖酵解水平，細胞增殖能力

17、下降，腫瘤細胞可能轉(zhuǎn)向耗氧更多的能量代謝途徑，比如氧化磷酸化等，以滿足自身生長代謝的需要;轉(zhuǎn)染LDHAshRNALenti.細胞凋亡增加，其機制可能是氧化磷酸化水平增高，細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生增加，NAC可以清除因LDHA抑制引起的ROS產(chǎn)生增加，也可抑制ROS引起的凋亡增加。抑制LDHA表達致HCCLM3細胞的細胞線粒體膜電位下降，胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流增加。Ca2+作為主要的細胞內(nèi)信使，參與調(diào)控許多細胞和組織的生理活動，Ca2+釋放，刺激PTP

18、敏感性增加，促進PTP的開放，PTP的開放可增加線粒體外膜的通透性，促進細胞色素-c釋放，活化Caspases-9，引發(fā)死亡蛋白酶Caspase級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細胞凋亡;抑制LDHA基因表達可上調(diào)E-cadherin表達，下調(diào)FAK表達，二者呈現(xiàn)的最終的生物學(xué)作用均為抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)染和侵襲發(fā)能力。與ControlshRNALenti.組和PBS組相比，LDHAshRNALenti.組VEGF、MMP-2表達下降，抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移發(fā)生。綜

19、合以上結(jié)果，我們得出這樣的推論:LDHA作為肝癌基因治療新的靶點，其抗腫瘤的機制，除了能抑制腫瘤優(yōu)勢獲能途徑—糖酵解，減少能量供給外，還可促解氧化磷酸化過程，而氧化磷酸化增強引起了ROS產(chǎn)生等一系列氧化應(yīng)激過程，最終導(dǎo)致腫瘤細胞凋亡發(fā)生。同時，LDHA具有癌基因的某些功能，調(diào)控著E-cadherin、FAK、VEGF和MMP-2等與侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因或蛋白質(zhì)表達，下調(diào)肝癌細胞LDHA基因可以抑制腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　結(jié)論：<

20、br>　　1.LDHA在肝癌細胞系和肝癌組織中高表達，LDHA表達水平與肝癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力及肝內(nèi)轉(zhuǎn)移發(fā)生相關(guān)。
　　2.RNA干擾下調(diào)LDHA表達后，肝癌細胞HCCLM3增殖侵襲能力下降，并引起裸鼠移植瘤腫瘤生長抑制，肝內(nèi)和肺內(nèi)轉(zhuǎn)移率下降，生存期延長，故認為LDHA是潛在的治療原發(fā)性肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移的靶標。
　　3.LDHA基因與糖代謝過程、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移等信號通路有關(guān)。抑制LDHA表達，可抑制糖酵解過程，減少ATP產(chǎn)生，細

21、胞增殖能力下降;致腫瘤細胞ROS產(chǎn)生、Ca2+內(nèi)流增加，影響線粒體膜電位，促進細胞色素-c釋放，活化Caspases-9，引發(fā)死亡蛋白酶Caspase級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細胞凋亡;抑制LDHA表達，可上調(diào)E-cadherin，下調(diào)FAK、VEGF和MMP-2表達，抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)染和侵襲能力。
　　創(chuàng)新點：
　　1.發(fā)現(xiàn)并證實LDHA參與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移過程，為預(yù)測和治療原發(fā)性肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)提供了新靶標。
　　2.初步探索靶向LD

22、HA的RNA干擾對肝癌細胞體外生長和侵襲的影響及抑制體內(nèi)成瘤、轉(zhuǎn)移的治療效果。
　　3.揭示了針對LDHA基因靶向治療的抗腫瘤作用機制，證實LDHA基因與糖酵解過程、凋亡途徑和侵襲轉(zhuǎn)移等信號通路有關(guān)。抑制LDHA表達，可抑制腫瘤細胞能量供應(yīng)，促進細胞凋亡，抑制或促進與侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因表達。
　　潛在應(yīng)用價值：
　　1.LDHA是抑制肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的潛在治療靶點。
　　2.為針對LDHA基因靶向治療的抗腫瘤藥物設(shè)計