半胱氨酰酰白三烯受體1拮抗劑孟魯司特抗腦缺血損傷的作用.pdf

1、本實驗室已經(jīng)證明半胱氨酰白三烯受體1(cysteinyl leukotriene receptor1，CysLT1受體)拮抗劑的抗腦缺血損傷作用。選擇性CysLT1受體拮抗劑普魯司特(pranlukast，ONO-1078)可抑制大鼠和小鼠的急性、亞急性及慢性局灶性腦缺血損傷。在小鼠局灶性腦缺血慢性期，普魯司特不僅可降低死亡率，促進神經(jīng)功能恢復，還可抑制膠質(zhì)疤痕形成。但是，有待進一步的闡明其他CysLT1受體拮抗劑抗腦缺血損傷的作用。在

2、細胞水平上，已經(jīng)報道CysLT1和CysLT2受體轉(zhuǎn)染對PC12細胞缺血性損傷的調(diào)節(jié)作用，CysLT1受體介導輕度缺血損傷后星形膠質(zhì)細胞增殖，但其在神經(jīng)元缺血損傷中的作用，還需要繼續(xù)深入探討。多數(shù)動物實驗采用的CysLT1受體拮抗劑是普魯司特，其作用是CysLT1受體拮抗劑共同的作用，還是該藥特有的作用?為此，研究了另一個CysLT1受體拮抗劑孟魯司特。孟魯司特[1-{[(1(R)-(3-(2-(7-氯-2-喹啉)-(E)-乙烯基)苯基

3、)-3-(2-(1-羥基-1-甲基乙基)苯基)丙基)硫醇]-甲基}環(huán)丙乙酸]是分子結(jié)構(gòu)不同于普魯司特的選擇性CysLT1受體拮抗劑。本實驗室發(fā)現(xiàn)，腹腔注射孟魯司特對小鼠急性局灶性腦缺血損傷有劑量依賴性保護作用，可減輕神經(jīng)癥狀、減小梗死體積、減輕神經(jīng)元缺失、減少血腦屏障通透性增高，治療時間窗在缺血后0.5 h，其作用強度和特點與普魯司特相似。但是，孟魯司特對局灶性腦缺血后慢性損傷的作用還未得到研究，因此，本研究第一部分在大鼠和小鼠局灶性腦

4、缺血模型中，觀察CysLT1受體拮抗劑孟魯司特對腦缺血慢性損傷是否有保護作用，口服是否有效。CysLT1受體拮抗劑除了選擇性阻斷CysLT1受體而發(fā)揮效應(yīng)外，還有不依賴于CysLT1受體的作用，孟魯司特是否也具有這種作用?另一方面，神經(jīng)元損傷受膠質(zhì)細胞等其他細胞的相互調(diào)節(jié)，孟魯司特是否影響膠質(zhì)細胞而調(diào)節(jié)神經(jīng)元缺血性損傷?針對這些問題，本研究第二部分在大鼠原代神經(jīng)元培養(yǎng)和皮質(zhì)細胞混合培養(yǎng)中，驗證孟魯司特在整體試驗中的神經(jīng)保護作用；同時，探

5、討其神經(jīng)元保護作用環(huán)節(jié)、是否依賴CysLT1受體以及與膠質(zhì)細胞作用的關(guān)系。本研究分為兩個部分：
　　 第一部分：孟魯司特對小鼠和大鼠局灶性腦缺血慢性損傷的作用。
　　 目的：⑴在小鼠模型闡明孟魯司特對局灶性腦缺血慢性損傷的治療作用，并與普魯司特進行比較。⑵在大鼠模型確定孟魯司特口服給藥，是否對慢性局灶性腦缺血損傷有保護作用，并與臨床有效的抗氧化藥依達拉奉(edaravone)進行比較。
　　 方法：以大腦中動脈阻

6、塞方法誘導局灶性腦缺血后，小鼠腹腔注射孟魯司特(0.01和0.1 mg/kg)，共5天；大鼠灌胃給予孟魯司特(0.1和0.5 mg/kg)，共5天。缺血后28天內(nèi)，觀察行為學異常以評價神經(jīng)功能損害，包括神經(jīng)癥狀評分、轉(zhuǎn)角試驗(小鼠)和伸爪試驗(大鼠)。28天后，觀察腦損傷體積、腦萎縮和神經(jīng)元缺失變化，以評估腦損傷改變。
　　 結(jié)果：孟魯司特(0.1 mg/kg)減輕小鼠局灶性腦缺血后的行為學異常、腦損傷體積、腦萎縮和神經(jīng)元缺失，

7、其作用與普魯司特(0.1 mg/kg)相似。大鼠經(jīng)口給予孟魯司特(0.5 mg/kg)也顯著減輕慢性損傷，其作用強于依達拉奉(10 mg/kg)；尤其對于提高伸爪試驗成功率的作用較為明顯。但是，孟魯司特對于大鼠和小鼠腦缺血后的死亡率沒有作用，表明其不能對抗非常嚴重的腦缺血損害。
　　 結(jié)論：⑴CysLT1受體拮抗劑孟魯司特對小鼠局灶性腦缺血慢性損傷有保護作用，其有效劑量為0.1 mg/kg，與普魯司特作用基本相仿。⑵口服孟魯司特

8、對大鼠局灶性腦缺血慢性損傷也具有顯著的保護作用，對改善大鼠術(shù)后精細行為改變有較顯著的作用，其有效劑量為0.5 mg/kg。這些發(fā)現(xiàn)支持CysLT1受體拮抗劑治療缺血性腦卒中的潛在價值。
　　 第二部分：孟魯司特對神經(jīng)元缺血性損傷的作用。
　　 目的：⑴確認孟魯司特對神經(jīng)元體外缺血性損傷有無保護作用；對凝血酶誘導的損傷(腦缺血后繼發(fā)性出血損傷)是否有保護作用。⑵確認孟魯司特對神經(jīng)元缺血性損傷的保護作用是否通過拮抗CysLT

9、1受體；與混合培養(yǎng)的膠質(zhì)細胞有無作用。
　　 方法：在大鼠皮層神經(jīng)元及混合培養(yǎng)細胞，選擇OGD及恢復的最佳損傷條件(OGD2 h/R24 h，OGD/R)；以凝血酶(1.1～100 U/ml)誘導神經(jīng)元損傷。損傷前以不同濃度孟魯司特及LTD4預處理。神經(jīng)元損傷以細胞存活率(MTT還原試驗)、LDH漏出率、凋亡率(Hoechst33258染色)、神經(jīng)元數(shù)量及形態(tài)加以評價；并觀察神經(jīng)元CysLT1受體表達(免疫染色)、活性氧(ROS

10、)產(chǎn)生、小膠質(zhì)細胞形態(tài)變化。
　　 結(jié)果：在神經(jīng)元，孟魯司特在0.01～10μM濃度范圍內(nèi)顯著保護OGD瓜誘導的缺血性損傷，減輕存活率降低、LDH漏出、凋亡率、神經(jīng)元數(shù)量減少及形態(tài)改變；孟魯司特對凝血酶誘導的神經(jīng)元損傷無保護作用。CysLT1受體激動劑LTD4(1～100nM)對神經(jīng)元OGD/R損傷的有一定的保護作用，但兩藥(孟魯司特0.01μM+LTD41～100 nM)無協(xié)同作用。孟魯司特(0.01～10μM)能顯著抑制OG

11、D瓜誘導神經(jīng)元ROS的產(chǎn)生，但LTD4(10～1000 nM)無顯著作用。在混合培養(yǎng)細胞，孟魯司特(0.0001～1μM)顯著改變OGD/R后神經(jīng)元形態(tài)，但LTD4(0.1～1000 nM)基本無作用。孟魯司特(0.0001～0.01μM)和LTD4(1～1000 nM)顯著減少OGD/R誘導的小膠質(zhì)細胞激活，但兩藥(孟魯司特0.01μM1+LTD4100 nM)無協(xié)同或拮抗作用。
　　 結(jié)論：⑴孟魯司特對OGD/R誘導的神經(jīng)元