TIM4對小鼠食物過敏模型中抗原特異性Th2細胞人化的影響.pdf

1、隨著新型抗生素和疫苗的發(fā)展及其在臨床上的應用，感染性疾病的治療已取得巨大成功，但在過去的幾十年，過敏性疾病卻呈現(xiàn)出明顯上升趨勢，大約15％-20％的人對外源抗原產(chǎn)生1gE介導的過敏反應，其中約有2％-6％的人存在食物過敏(food allergy, FA)及相關癥狀。近年雖然過敏性疾病成為研究熱點且已有較多的研究，但是過敏性疾病的發(fā)病機制及病因?qū)W仍不清楚，其治療方法有限且效果不佳。
　　 研究顯示樹突狀細胞(dendritic

2、cell，DC)和Th2細胞在過敏免疫反應中具有關鍵作用。DC是機體內(nèi)功能最強的抗原提呈細胞(antigen presenting cell，APC),也是唯一能激活初始T細胞的APC，DC捕獲和加工外源性抗原，并遞呈抗原信息給T細胞，激活T細胞介導的免疫反應。成熟的DC高表達MHC-Ⅰ／Ⅱ類分子、共刺激分子如CD80和CD86等協(xié)助抗原信息的遞呈，有效活化T細胞。初始CD4+T細胞被激活后分化為Th1、Th2、Th17或Treg細胞，

3、Th2細胞主要釋放細胞因子IL-4、IL-5和IL-13。這些細胞因子不僅在誘導B細胞產(chǎn)生抗原特異性IgE中起重要作用，而且在粘液分泌、肌肉收縮、和嗜酸性粒細胞增多中起重要作用。當再次暴露于特異性抗原后，IgE交叉連接激活肥大細胞釋放過敏性介質(zhì)，促發(fā)過敏性反應和產(chǎn)生過敏性臨床癥狀。因此Th2細胞的極化是食物過敏免疫機制中重要一步。
　　 T細胞免疫球蛋白與黏蛋白域蛋白(T cell immunoglobulin and muci

4、n domains，TIMs)基因家族是一組新的細胞表面蛋白家族。已發(fā)現(xiàn)TIMs基因家族在小鼠中包括8個成員(TIMs1-8)和在人類中3個成員(TIM1，3和4)。研究顯示TIMs在過敏性疾病和自身免疫性疾病中起重要的調(diào)節(jié)作用。其中TIM4表達于APC，尤其是成熟的DC，TIM1表達于T細胞，特別是Th2細胞，近來發(fā)現(xiàn)它們是T細胞重要的調(diào)節(jié)因子。體外研究顯示DC中TIM4蛋白的表達與自身免疫性疾病的嚴重程度正相關，TIM4結合TIM1

5、共同促進T細胞的增殖，且提示TIM4可能作為一個新的分子來調(diào)節(jié)T細胞反應。我們前期研究，顯示在過敏小鼠中存在Treg細胞功能不全，TIM4與TIM1的相互作用可降低Treg細胞的功能及狀態(tài)，破壞免疫耐受平衡。但是TIM4對食物抗原特異性Th2細胞分化的影響研究甚少，體外實驗證據(jù)不多，其機制仍需進一步研究。
　　 我們推測微生物產(chǎn)物和食物抗原共同作用能夠?qū)е翭A，其中TIM4與其受體的相互作用可能導致Th1/Th2細胞失衡和免疫耐

6、受的打破，是引起FA的關鍵。本研究將通過體外培養(yǎng)BMDC，與CD4+T細胞共同培養(yǎng)來研究微生物產(chǎn)物和食物抗原對CD4+T細胞的影響，并應用TIM4抗體干預，探討TIM4在FA發(fā)病過程中的作用，從而進一步了解食物過敏發(fā)生的分子機制，并為臨床治療提供理論依據(jù)。
　　 目的:
　　 通過檢測TIM4 mRNA的表達，DC表面分子CD11c、MHC-Ⅱ、CD86的表達，研究微生物產(chǎn)物對TIM4的作用和微生物產(chǎn)物對DC的刺激作用。

7、使用SEB和OVA共同作用于BALB/c小鼠，分離過敏小鼠脾臟CD4+T細胞，和DC在不同條件下共同培養(yǎng)，檢測細胞上清液中Th1/Th2細胞因子的水平。探討在微生物產(chǎn)物參與的食物過敏( food allergy, FA)中TIM4對CD4+T細胞分化的影響。
　　 方法:
　　 培養(yǎng)BALB/c小鼠骨髓來源的樹突狀細胞(bone marrow-derived DC，BMDC)，培養(yǎng)的DC分為兩組：金黃色葡萄球菌腸毒素B(

8、SEB)刺激組和空白對照組。使用SEB和OVA致敏BALB/c小鼠，取過敏模型小鼠脾臟CD4+T細胞，和DC細胞共同培養(yǎng)分為5組：空白對照組、SEB+卵清蛋白(OVA)共同作用組、SEB組、OVA組及TIM4抗體干預組。進行相關指標的檢測。
　　 1．RT-PCR檢測DC的TIM4mRNA表達。
　　 2．流式細胞儀檢測DC表面CD11c、MHC-Ⅱ、CD86的表達。
　　 3．ELISA法測定混合培養(yǎng)細胞上清液

9、IL-4與IFN-γ的表達。
　　 所得數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行分析。組間均值比較采用單因素方差分析，以α=0.05為假設檢驗標準。
　　 結果:
　　 1．體外分離骨髓細胞，誘導分化為樹突狀細胞，通過流式細胞儀檢測特征性標志CD11c純度可達70％，并具有特征性形態(tài)。
　　 2．使用SEB刺激DC，與空白對照組相比，SEB刺激組DC TIM4 mRNA表達明顯增高（0.941±0.018

10、 vs0.422±0.083，均P＜0.05），并具有劑量依從性。
　　 3．使用SEB刺激DC，流式細胞儀檢測：SEB刺激組DC表面分子MHC-Ⅱ、CD86表達明顯高于空白對照組(MHC-Ⅱ:76.684％±3.1803％vs52.984％±3.6026％,P=0.000;CD86:89.746％±2.113％vs67.558％±0.4341％,P=0.000)。
　　 4．DC和CD4+T細胞共同培養(yǎng)中，相比對照組，

11、SEB+OVA組IL-4表達顯著增高(295.834±20.408vs78.335±13.109，均P＜0.05)，而IFN-γ的表達明顯減少（362.109±92.271vs761.897±102.967，均P＜0.05）；SEB組或OVA組IL-4和IFN-γ與空白對照組無明顯差異：DC和CD4+T細胞共同培養(yǎng)中應用TIM4抗體干預后，結果顯示對比SEB+OVA組IL-4明顯降低，而IFN-γ的表達明顯增高(P均＜0.05)，與對照

12、組、SEB組和OVA組相比兩種細胞因子的表達無統(tǒng)計學差異。
　　 結論:
　　 1．SEB刺激DC增加TIM4的表達。
　　 2．SEB刺激DC促進DC上MHC-Ⅱ和共刺激分子CD86表達上調(diào)，促進DC功能成熟。
　　 3．SEB和OVA共同刺激促進CD4+T細胞分化為Th2細胞，共同導致食物過敏。單一的SEB或者OVA不能引起食物過敏反應。
　　 4．TIM4抗體干預抑制Th2細胞分化，有效糾正