清肺消炎丸及有效成分緩解哮喘的系統(tǒng)生物學(xué)研究.pdf

1、哮喘為眾多細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道炎癥疾病。在體內(nèi)外因素的作用下，可能導(dǎo)致支氣管的高反應(yīng)性、支氣管上皮結(jié)構(gòu)發(fā)生改變、氣道和肺組織重構(gòu)以及呼吸功能異常。全球哮喘疾病的發(fā)生發(fā)展都呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。目前哮喘治療藥物主要圍繞兩個(gè)方面，一是利用支氣管擴(kuò)張劑治療急性哮喘發(fā)作癥狀，二是利用抗炎藥物對(duì)于慢性炎癥的長(zhǎng)期治療。臨床使用哮喘治療藥物包括β2受體激動(dòng)劑、M受體拮抗劑、糖皮質(zhì)激素、白三烯調(diào)節(jié)劑、胰蛋白酶抑制劑、免疫抑制劑、抗氣道重塑藥物、基因治療等。

2、
　　清肺消炎丸是根據(jù)醫(yī)圣張仲景所著《傷寒論》中的經(jīng)典名方“麻杏石甘湯”為基礎(chǔ)的復(fù)方丸劑，有清肺化痰、止咳平喘之功效。臨床用于痰熱阻肺、咳嗽氣喘、胸脅脹痛、吐痰黃稠;以及上呼吸道感染、急性支氣管炎、慢性支氣管炎急性發(fā)作等證候者。我們前期研究中發(fā)現(xiàn)，清肺消炎丸對(duì)組胺致喘豚鼠的哮喘潛伏期有明顯的延長(zhǎng)作用，能有效減少豚鼠的咳嗽次數(shù);對(duì)豚鼠離體氣管收縮的抑制效果較好，但其平喘作用機(jī)理方面的研究尚不夠深入。本課題旨在從系統(tǒng)生物學(xué)角度探討清肺

3、消炎丸緩解哮喘的作用機(jī)制。
　　在本研究中的清肺消炎丸的系統(tǒng)生物學(xué)研究部分，首先建立豚鼠哮喘模型，并給予清肺消炎丸干預(yù)治療;發(fā)現(xiàn)清肺消炎丸給藥組明顯延緩哮喘發(fā)作開(kāi)始時(shí)間，并且支氣管和肺組織病理切片顯示給藥后氣道和肺組織炎癥、水腫、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、氣道重塑現(xiàn)象都明顯減輕，表明清肺消炎丸緩解哮喘的藥效良好。然后設(shè)計(jì)并定制Agilent4×44K雙通道豚鼠全基因組表達(dá)譜芯片對(duì)模型組和給藥組的肺組織進(jìn)行基因表達(dá)差異的篩查，共篩選豚鼠差異

4、基因55條。對(duì)差異表達(dá)基因的Cluster聚類分析結(jié)果顯示，清肺消炎丸組的基因表達(dá)特征與正常對(duì)照組樣本較為接近，提示給藥后整體基因表達(dá)水平有恢復(fù)正常的趨勢(shì)。經(jīng)Blast比對(duì)獲得相應(yīng)的人源基因27條，參與了炎癥信號(hào)傳遞、氣道平滑肌細(xì)胞凋亡、平滑肌重構(gòu)、基質(zhì)蛋白分泌等生物學(xué)過(guò)程。其中MAPK3，RHO，VIM，CLU，GNB1，ENO1(3)基因的熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果與芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本相符，表明了芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性。
　　而后，采用

5、蛋白質(zhì)二維電泳-基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)對(duì)模型組和給藥組樣本進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)研究。通過(guò)二維電泳篩選差異蛋白，并對(duì)其中6條差異蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，發(fā)現(xiàn)其與炎癥、哮喘、機(jī)體對(duì)藥物敏感性、肺組織重構(gòu)等相關(guān)，并對(duì)其中Hsp90的基因和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了驗(yàn)證。將上述差異基因及差異蛋白對(duì)應(yīng)基因進(jìn)行GO基因功能注釋、KEGG信號(hào)通路分析，發(fā)現(xiàn)各差異分子分別定位于多種細(xì)胞通路，共同參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞骨架及胞外基質(zhì)調(diào)控、平滑肌收縮等信號(hào)通路。將

6、實(shí)驗(yàn)確定的總的差異基因，基于HPRD數(shù)據(jù)庫(kù)蛋白互作關(guān)系，投注于GAD數(shù)據(jù)庫(kù)中哮喘相關(guān)的基因網(wǎng)絡(luò)中，獲得清肺消炎丸靶點(diǎn)與哮喘相關(guān)基因互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，共含有1214個(gè)節(jié)點(diǎn)和1886個(gè)互作關(guān)系，表明清肺消炎丸的作用靶點(diǎn)與哮喘疾病相關(guān)基因有直接和間接的相互作用關(guān)系，對(duì)于探討清肺消炎丸治療哮喘、肺部炎癥等疾病的作用機(jī)制提供有意義參考。
　　基于前期對(duì)于清肺消炎丸化學(xué)物質(zhì)組學(xué)及藥物作用通路的分析發(fā)現(xiàn)，牛蒡子苷元是清肺消炎丸中木質(zhì)素類的代表成分

7、，可能通過(guò)ERK/MAPK通路發(fā)揮抗炎作用。本研究進(jìn)一步選擇了牛蒡子苷元單體成分，對(duì)其緩解氣道收縮、對(duì)氣道平滑肌以及平滑肌細(xì)胞內(nèi)的鈣離子的影響、以及電生理方面的影響進(jìn)行探索研究。
　　在牛蒡子舒張氣道平滑肌的研究中，首先通過(guò)氣管條張力測(cè)定的實(shí)驗(yàn)詳細(xì)考察了牛蒡子苷元對(duì)緩解不同收縮劑致敏的豚鼠氣管條的收縮現(xiàn)象，并進(jìn)一步通過(guò)膜片鉗記錄牛蒡子苷元對(duì)L-型鈣離子通道的影響和激光共聚焦顯微鏡(Confocal)來(lái)測(cè)定牛蒡子苷元影響支氣管平滑肌

8、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，初步探索了其氣管舒張作用的機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在正常K-H液中，牛蒡子苷元(0.1μM-1mM)可緩解10μM乙酰膽堿、10μM組胺、10mM氯化鉀、30mM氯化鈣不同預(yù)收縮劑所導(dǎo)致氣管條的收縮，預(yù)孵育0.1mM牛蒡子苷元也可緩解氣管條對(duì)收縮劑的反應(yīng)，提示牛蒡子苷元可能通過(guò)不同機(jī)制緩解氣管條收縮。在無(wú)鈣K-H液中，牛蒡子苷元能顯著降低氣管條收縮，提示牛蒡子苷元能降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，可能促進(jìn)胞漿中的鈣離子進(jìn)入肌漿網(wǎng)或

9、者促進(jìn)鈣離子排出胞外。膜片鉗檢測(cè)發(fā)現(xiàn)0.01mM牛蒡子苷元可降低人支氣管平滑肌細(xì)胞(HBSMC)膜鈣離子通道電流。Confocal顯示牛蒡子苷元能促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鈣離子排出和抑制細(xì)胞外鈣離子入胞，進(jìn)而降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。推測(cè)牛蒡子苷元通過(guò)影響L-型鈣離子通道而降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度可能是其中一種作用機(jī)制。
　　綜上所述，我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)篩選及驗(yàn)證了清肺消炎丸可能的作用靶點(diǎn)，并構(gòu)建了與哮喘相關(guān)基因的相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，揭示了清肺消炎丸多成分、多