脊髓前角運動神經(jīng)元-骨骼肌細胞共培養(yǎng)體系的建立.pdf

1、失神經(jīng)喉肌等骨骼肌的再生和功能重建是臨床關(guān)注的熱點，而神經(jīng)肌肉接頭重建和成肌干細胞分化融合修復受損肌纖維是失神經(jīng)骨骼肌再生和功能恢復的關(guān)鍵。因此，為了更好的研究失神經(jīng)喉肌等骨骼肌的再生機制，從而為干預神經(jīng)肌肉再生關(guān)鍵分子事件提供新的治療策略和理論依據(jù)，建立一個適當?shù)捏w外模型顯得至關(guān)重要。而脊髓前角運動神經(jīng)元-骨骼肌細胞共培養(yǎng)就是其中的關(guān)鍵技術(shù)之一。
　　 目前，大部分已知的神經(jīng)肌肉體外共培養(yǎng)模型均采用含血清培養(yǎng)基，這為體外神經(jīng)肌

2、肉接頭的形成提供了一個功能性的模型系統(tǒng)，但血清的使用也增加了不必要的變異性，由于使用血清使重復體外神經(jīng)肌肉共培養(yǎng)體系時描述和量化所需的最低因素變得不可能，因此，也有人設計了新型的無血清培養(yǎng)技術(shù)用于神經(jīng)肌肉共培養(yǎng)，以促進功能性的神經(jīng)肌肉接頭的形成。
　　 運動神經(jīng)元及骨骼肌細胞的取材也不盡相同，而其中培養(yǎng)體外分離的胚胎神經(jīng)元和骨骼肌細胞便利了對脊椎動物神經(jīng)肌肉接頭發(fā)展過程的分析，復制組織型的細胞與細胞之間的相互作用往往很難達到分離

3、胚胎干細胞所能達到的效果。從脊髓外植體獲得的胚胎運動神經(jīng)元或者軸突與骨骼肌細胞的培養(yǎng)，容易形成功能性的突觸，可以達到很高程度的結(jié)構(gòu)和功能的分化。目前，對體外神經(jīng)肌肉突觸形成中分離細胞培養(yǎng)的研究已經(jīng)取得了一些關(guān)鍵性的成果。
　　 在過去的研究中，Chen等采用NG108-15/C2C12共培養(yǎng)模型用來測定肌管上形成的作為神經(jīng)肌肉接頭形成最早的標記物乙酰膽堿受體(AchR)簇集。雖然NG108-15細胞可以長出軸突并延伸到附近的肌管

4、，但由于NG108-15細胞為小鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞與大鼠膠質(zhì)瘤細胞之融合細胞，其特性和功能狀態(tài)都遠不能完全代替神經(jīng)元原代細胞，故在共培養(yǎng)3天后，NG108-15細胞逐漸凋亡，AchR的聚集也明顯降低。亦有研究證明，大鼠神經(jīng)元-肌肉共培養(yǎng)可以形成大量的早期NMJ，并可以檢測到神經(jīng)元軸突誘導的突觸后膜AchR的聚集，但由于原代骨骼肌衛(wèi)星肌細胞取材難度較大，純化過程較為繁雜，培養(yǎng)條件較高且傳至9代后細胞即出現(xiàn)衰老特征，不能無限代地進行傳代培養(yǎng)

5、。
　　 因此，本實驗擬在此基礎上進行適當?shù)馗倪M，首次采用SD大鼠胎鼠脊髓前角運動神經(jīng)元原代細胞和C2C12細胞進行共培養(yǎng)，在體外建立一個穩(wěn)定的神經(jīng)肌肉接頭(NMJ)模型，該共培養(yǎng)操作過程更為簡單，重復性好，細胞狀態(tài)佳，存活時間更久，且更易于分析，從而為進一步研究體內(nèi)外神經(jīng)肌肉接頭功能狀態(tài)及再生奠定基礎。
　　 第一部分胚胎大鼠脊髓前角運動神經(jīng)元原代分離和培養(yǎng)
　　 研究目的:能夠熟練的進行原代神經(jīng)細胞的提取與培

6、養(yǎng)，并進行提純和鑒定，以獲取體外形成神經(jīng)肌肉接頭所需的胚胎大鼠脊髓前角運動神經(jīng)元。
　　 材料和方法:取孕15d～16d SD大鼠，取出胚胎大鼠腹側(cè)半脊髓組織，經(jīng)胰酶消化和機械破碎的方法處理分散成單個細胞，經(jīng)差速貼壁法純化運動神經(jīng)元，置于無血清限定性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞得以生存、生長和繁殖，倒置顯微下觀察神經(jīng)元形態(tài)、結(jié)構(gòu)的變化，并采用免疫熒光法檢測脊髓運動神經(jīng)元特異性標記物膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶多克隆抗體(ChAT)以鑒定運動神經(jīng)元。

7、
　　 結(jié)果:孕15d～16d胎鼠易于取材且所得運動神經(jīng)元細胞數(shù)量多、狀態(tài)好、細胞活力旺盛，聯(lián)合Neurobasal+2％ B27培養(yǎng)基培養(yǎng)的脊髓前角運動神經(jīng)元細胞純度高，約為85％，能夠在體外培養(yǎng)條件下存活7～10d左右，ChAT反應結(jié)果呈現(xiàn)陽性。
　　 結(jié)論:通過采用胎齡15d～16d胎鼠脊髓腹側(cè)半聯(lián)合無血清特定性培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞的方法成功分離培養(yǎng)并獲得純度較高的脊髓前角運動神經(jīng)元，ChAT能夠特異性標記脊髓運動神經(jīng)元

8、，且培養(yǎng)前5～7天，MNs數(shù)量穩(wěn)定，未見明顯減少，為課題實施提供可靠的運動神經(jīng)元來源，同時也為后續(xù)共培養(yǎng)體系的建立在時間上創(chuàng)造了條件。
　　 第二部分成肌細胞C2C12體外成肌分化模型的建立
　　 研究目的:完善肌母細胞C2C12體外培養(yǎng)方法，觀察細胞增殖、分化、融合成肌的生物學特性。
　　 材料與方法:體外培養(yǎng)成肌細胞C2C12，在含10％胎牛血清的增殖培養(yǎng)液(GM)中擴增培養(yǎng)，待細胞生長至密度為60％～70％

9、時，換為含2％馬血清的分化培養(yǎng)液(DM)誘導分化。倒置顯微鏡下觀察各個階段骨骼肌細胞的形態(tài)特征變化并拍照。采用免疫熒光法抗肌球蛋白重鏈抗體MHC特異性標記肌管。
　　 結(jié)果:體外培養(yǎng)時，C2C12細胞匯合至60％～70％時，換DM誘導分化，即開始逐步相互融合形成肌管細胞并表達MHC蛋白，約5d左右形成成熟的肌管，MHC特異性反應呈陽性。
　　 結(jié)論:成肌細胞C2C12體外培養(yǎng)時能夠穩(wěn)定傳代，無需特殊誘導方法，用含2％馬血

10、清的分化培養(yǎng)液(DM)即可誘導分化形成成熟的肌管細胞，為共培養(yǎng)體系的建立提供穩(wěn)定的骨骼肌肌管來源。
　　 第三部分運動神經(jīng)元-骨骼肌細胞共培養(yǎng)體系的建立
　　 研究目的:獲得運動神經(jīng)元-骨骼肌細胞共培養(yǎng)條件，建立運動神經(jīng)元-骨骼肌細胞共培養(yǎng)體系，在體外形成神經(jīng)肌肉接頭。
　　 材料與方法:C2C12成肌細胞株體外擴增培養(yǎng)至60％～70％匯合時，分化培養(yǎng)基(DM)誘導分化，培養(yǎng)約3d，開始分化融合形成肌管。取孕15

11、d～16dSD大鼠，提取胚胎大鼠脊髓前角運動神經(jīng)元細胞，種植到分化5d的肌管細胞中，含2％馬血清的分化培養(yǎng)液(DM)共培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察各個階段神經(jīng)元形態(tài)及突起長度的變化、肌管形態(tài)特征變化及收縮特性、神經(jīng)肌肉接頭的形成。通過活體細胞孵育alpha-bungarotoxin(a-BTX)觀察突觸后膜AchR的位置及分布，并采用屏幕錄像技術(shù)記錄共培養(yǎng)中肌肉收縮現(xiàn)象，這從另一個方面證明共培養(yǎng)后NMJ的形成。
　　 結(jié)果:更換為共培

12、養(yǎng)培養(yǎng)基后，SKMs和MNs均能存活并進一步地分化成熟。在共培養(yǎng)細胞中，MNs在形態(tài)學上易于鑒別，共培養(yǎng)約4h后，倒置顯微鏡下可觀察到部分脊髓運動神經(jīng)元開始貼壁，呈單個圓形或橢圓形，12h后，大部分細胞均已貼壁，24h后，NMs胞體逐漸形成突起，肌管細胞迸一步融合增粗并相互形成網(wǎng)絡狀，第3d～5d，神經(jīng)元生長旺盛、胞體飽滿、光暈明顯、突起增多并延長，部分NMs開始與肌管細胞形成連接;約1周左右可見NMs伸出的軸突延伸至肌管膜表面或包繞肌