斯氏貍殖吸蟲排泄分泌產物免疫活性分析及免疫診斷應用.pdf

1、目的:分析斯氏貍殖吸蟲童蟲、成蟲排泄分泌產物(Excretory secretoryproducts,ESP)的蛋白分子量和抗原性,并對兩者進行免疫組織定位,通過體內實驗觀察其活化小鼠腹腔巨噬細胞的類型。以ESP為特異診斷抗原,制備膠體金免疫層析試紙條,建立一種快速診斷并殖吸蟲病的免疫診斷方法。
　　 方法:(1)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離斯氏貍殖吸蟲童蟲ESP、蟲體可溶性蛋白和成蟲ESP、蟲體可

2、溶性蛋白,采用蛋白質印跡(Western blot)技術分別用肺吸蟲病人血清、小鼠感染血清識別特異性反應條帶,并用酶標免疫組織化學技術對ESP進行組織定位。(2)蟲體抗原皮下免疫BALB／c小鼠,腹腔注射童蟲ES抗原后不同的時間點收集腹腔巨噬細胞。用異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)標記的抗鼠甘露糖受體(Mannose Receptor,MR,又稱CD206)抗體識別巨噬細胞上的膜受體,通過

3、共聚焦顯微鏡觀察細胞表面熒光強度。半定量PCR分析誘導性一氧化氮合酶(inducible NO synthase,iNOS),精氨酸酶(arginase-1),CD206的基因表達情況。(3)還原法制備膠體金溶液,并用透射電子顯微鏡和紫外可見分光光度儀對膠體金顆粒的粒徑、聚集情況、與兔抗人IgG的結合情況進行檢測,制備出均勻的、分散的高質量膠體金。用斯氏貍殖吸蟲ES抗原和葡萄球菌A蛋白噴于帶背襯的硝酸纖維素膜,分別作為檢測線、質控線。用

4、膠體金標記的兔抗人IgG去檢查病人血清中的抗體。
　　 結果:(1)經SDS-PAGE分離斯氏貍殖吸蟲的蟲體可溶性蛋白和ESP,Western blot分析顯示,病人血清識別的童蟲ESP主帶在28、70kDa,成蟲ESP主帶在90kDa處；小鼠感染血清識別的童蟲ESP主帶在28、70kDa,成蟲ESP主帶在45、70kDa處。童蟲ESP主要定位在后尾蚴的排泄囊,成蟲ESP主要定位在成蟲腸腔上皮。(2)激光共聚焦顯微鏡檢測到活化巨

5、噬細胞表面綠色熒光,且在第3天時熒光值最強。RT-PCR檢測到ESP活化小鼠腹腔巨噬細胞有arginase-1、CD206基因表達,但不表達iNOS。(3)用膠體金免疫層析試紙條檢測肺吸蟲病血清54份,健康人血清34份,其敏感性是94.44％(51／54)特異性是94.22％(32／34),與ELISA檢測法相比沒有就較大差異。檢測血吸蟲病人血清25份和肝吸蟲病人血清15份,其交叉反應率分別為4％(1／25)和6.67％(1／15)。試