鴉膽子提取物抗雞球蟲病效果評(píng)價(jià)及作用機(jī)制研究.pdf

1、雞球蟲病是雞常見(jiàn)的寄生蟲病，危害嚴(yán)重，每年對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前該病防治工作的開展主要依靠藥物，但是隨著蟲株耐藥性的產(chǎn)生，部分抗球蟲藥物的效果大大降低甚至完全失效，因此發(fā)現(xiàn)新的藥物刻不容緩。藥用植物鴉膽子具有抗癌、抗阿米巴原蟲、抗巴貝斯蟲和抗瘧疾等多種功效，但其抗球蟲活性仍有待研究。本研究通過(guò)人工感染雞球蟲病模型評(píng)價(jià)鴉膽子提取物的體內(nèi)治療效果，利用熒光定量PCR技術(shù)在體外檢測(cè)鴉膽子提取物對(duì)球蟲增殖的影響，并運(yùn)用電子顯微鏡觀察鴉

2、膽子處理對(duì)卵囊或子孢子形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)的改變，初步探索鴉膽子提取物的抗球蟲作用機(jī)制。
　　一、鴉膽子提取物制備及化學(xué)成分鑒定
　　為制備實(shí)驗(yàn)所需的鴉膽子提取物，本試驗(yàn)運(yùn)用薄層色譜法對(duì)藥用植物進(jìn)行理化鑒定，通過(guò)乙醇回流法結(jié)合萃取方法制備鴉膽子提取物，并采用氣象色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)對(duì)其中的提取物鴉膽子油進(jìn)行了化學(xué)成分分析。形態(tài)學(xué)觀察及理化鑒定結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)材料為苦木科植物Bruceajavanica(L.)Merr.成

3、熟干燥的果實(shí)。實(shí)驗(yàn)制備了三種鴉膽子提取物，分別為石油醚提取物（Brucea javanica petroleum ether extract，BJ-PE）、乙醇提取物(Brucea javanica ethonal extract，BJ-EE)和水提物（Brucea javanica water extract，BJ-WE），GC-MS分析結(jié)果表明鴉膽子油（即石油醚提取物）主要包含油酸等長(zhǎng)鏈的脂肪酸、脂肪醇類化合物以及少量芳香族揮發(fā)性成

4、分。
　　二、鴉膽子醇提物對(duì)雞球蟲病的治療作用研究
　　為明確鴉膽子提取物對(duì)雞球蟲病的治療作用，實(shí)驗(yàn)一將雞分為5組:鴉膽子醇提物實(shí)驗(yàn)組（2.5g及5g生藥每千克飼料）、常山酮陽(yáng)性對(duì)照組、感染不給藥組和不感染不給藥組，每組10只雞，攻蟲后檢測(cè)雞便血、糞便卵囊數(shù)量和組織病變程度。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組雞只的血便排出量和病變計(jì)分顯著降低（P＜0.05），但體重變化不顯著，且抗球蟲指數(shù)最高僅為131，顯示輕度抗球蟲效果?；?/p>

5、上述結(jié)果設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)二，增設(shè)較高劑量的鴉膽子醇提物組(10g生藥每千克飼料)，每組10只雞，檢測(cè)指標(biāo)同上。結(jié)果顯示增設(shè)的高劑量給藥組抗球蟲指數(shù)最高可達(dá)146，具有中等強(qiáng)度的抗球蟲效果。在實(shí)驗(yàn)二的基礎(chǔ)上，將實(shí)驗(yàn)三每組雞數(shù)量擴(kuò)大至20只，檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果進(jìn)一步顯示，鴉膽子醇提物能有效減少雞血便的產(chǎn)生，降低卵囊排出量和盲腸中第二代裂殖體的數(shù)量，減輕盲腸病變程度，且對(duì)病雞體重增重?zé)o顯著影響;低、中、高劑量下抗球蟲指數(shù)分別為154、161和155，

6、達(dá)到了中等或良好的抗球蟲效果。綜上，本試驗(yàn)表明鴉膽子醇提物具有顯著的抗雞球蟲作用，可作為抗雞球蟲病的候選藥物作進(jìn)一步研究。
　　三、鴉膽子醇提物與鴉膽子素-D體外抗球蟲活性研究
　　為研究鴉膽子醇提物(BJ-EE)和鴉膽子特征性化合物鴉膽子素-D(Bruceine-D)的體外抗球蟲活性，本試驗(yàn)利用MDBK細(xì)胞系建立柔嫩艾美耳球蟲的體外培養(yǎng)體系，采用MTT法測(cè)定BJ-EE和Bruceine-D對(duì)MDBK細(xì)胞的毒性，并基于上述試

7、驗(yàn)結(jié)果明確了體外抗球蟲實(shí)驗(yàn)采用的藥物濃度分別為BJ-EE(2、1、0.5、0.25和0.125μg/ml)、Bruceine-D(0.8、0.4、0.2、0.1和0.05μg/ml),藥物作用時(shí)間分別為24h、48h和65h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BJ-EE(2μg/ml)和Bruceine-D(0.8μg/ml)作用于細(xì)胞65h時(shí)，細(xì)胞存活率在90％以上;與對(duì)照組相比，BJ-EE實(shí)驗(yàn)組中球蟲DNA增殖量顯著降低，Bruceine-D除48h、

8、0.05μg/ml實(shí)驗(yàn)組均表現(xiàn)出了顯著差異，即具有抑制球蟲增殖的作用;且球蟲DNA增殖量在48h和65h時(shí)呈現(xiàn)藥物劑量依賴性，即藥物濃度越高則球蟲的增殖量越低。綜上所述，BJ-EE和Bruceine-D在體外具有良好的抗球蟲活性。
　　四、鴉膽子提取物抗雞球蟲病作用機(jī)制初步探索
　　為明確鴉膽子提取物治療雞球蟲病的作用機(jī)制，本研究使用不同濃度的石油醚提取物(BJ-PE)、乙醇提取物(BJ-EE)、水提物(B J-WE)和Br

9、uceine-D孵育處理未孢子化卵囊，并利用光學(xué)顯微鏡和透射電鏡觀察作用后球蟲子孢子形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的改變。觀察可見(jiàn)乙醇提取物、水提取物和Bruceine-D均表現(xiàn)出抑制卵囊孢子化的作用;乙醇提取物和Bruceine-D處理后的子孢子呈現(xiàn)皺縮、變圓、變短、細(xì)胞輪廓模糊、細(xì)胞膜破裂的現(xiàn)象，且胞內(nèi)細(xì)胞器排列混亂，細(xì)胞結(jié)構(gòu)扭曲，呈現(xiàn)病態(tài)的啞鈴型。該結(jié)果表明鴉膽子對(duì)球蟲卵囊孢子化具有輕微抑制作用，并在子孢子階段具有比較顯著的殺傷作用。因此，鴉膽子