芋艿脫毒試管球莖誘導(dǎo)及成球分子機(jī)理研究.pdf

1、芋艿,又稱(chēng)芋,芋頭,毛芋頭,是原產(chǎn)于我國(guó)的重要蔬菜種質(zhì)資源.近年來(lái)由于病毒侵染,導(dǎo)致品種退化,品質(zhì)降低,嚴(yán)重影響了芋艿,尤其是我國(guó)名特優(yōu)芋艿品種的生產(chǎn)和發(fā)展. 本文通過(guò)田間調(diào)查、電鏡負(fù)染和核酸斑點(diǎn)雜交的方法,分析了崇明特產(chǎn)品種崇明‘香酥芋'和崇明縣主栽品種浙江‘紅梗芋'芋花葉病毒病的發(fā)病情況,初步推斷崇明縣境內(nèi)芋艿已被芋花葉病毒侵染. 莖尖分生組織培養(yǎng)是生產(chǎn)脫毒苗最主要的方法.莖尖褐變和污染率高是芋艿莖尖脫毒過(guò)程的兩大難

2、題.本文研究了外植體滅菌方法、莖尖大小、外植體的接種時(shí)間對(duì)莖尖誘導(dǎo)和分化的影響.結(jié)果表明,同0.1﹪的HgCl<,2>處理7-13min相比,飽和的漂白粉溶液處理25min顯著降低了莖尖的褐變率,提高了莖尖的分化率,并使莖尖的污染率大幅度降低.莖尖培養(yǎng)中莖尖的誘導(dǎo)率和脫毒率是一對(duì)矛盾.由于酚類(lèi)化合物含量高,芋莖尖很容易褐變.通過(guò)試驗(yàn),我們建立了0.3-0.5mm莖尖,二次莖尖培養(yǎng)結(jié)合28℃-38℃熱處理,電鏡檢測(cè)脫毒率為100﹪的脫病毒

3、苗.另外,球莖的貯藏時(shí)間影響莖尖的污染率、褐變率和分化率.在正常的田間條件下采收,8-10℃條件下貯藏,比較適合芋莖尖培養(yǎng)的時(shí)間為3-4月. 另外,芋艿莖尖分化率低,分化慢,限制了芋莖尖脫毒苗的生產(chǎn).本文研究了瓊脂濃度、無(wú)機(jī)鹽含量、活性炭以及培養(yǎng)基中激素含量和不同培養(yǎng)方式等對(duì)芋艿莖尖誘導(dǎo)、分化和增殖的影響.比較了培養(yǎng)基中添加0、3、5、7、9g/l的瓊脂對(duì)于芋莖尖誘導(dǎo)分化和增殖的影響,其中5g/l的瓊脂最有利于莖尖的誘導(dǎo)分化和試

4、管苗的增殖,低的瓊脂濃度也有利于試管苗株高的增長(zhǎng).1/2MS培養(yǎng)基有利于莖尖的分化,MS培養(yǎng)基有利于莖尖的增殖,而且2月接種的莖尖和4月接種的莖尖對(duì)無(wú)機(jī)鹽表現(xiàn)出同樣的反應(yīng).0.5﹪的活性炭顯著降低莖尖的褐變率,縮短轉(zhuǎn)綠的時(shí)間并提高莖尖的分化率.培養(yǎng)基中加入1.0 mg/1的TDZ提高了轉(zhuǎn)綠率,并顯著提高了莖尖的分化率.液體培養(yǎng)有利于莖尖的增殖.將分化的莖尖轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中,我們發(fā)現(xiàn),1.0 mgl<'-1>BAP+0.5 mgl<'-1

5、>NAA有利于莖尖的快速起動(dòng)分化,在轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基30d后統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),該處理的試管苗增殖率最高,而3.0 mgl<'-1>BAP+0.1 mgl<'-1>TDZ有利于試管苗的長(zhǎng)期增殖. 試管成球是脫毒苗田間應(yīng)用的關(guān)鍵.本文研究了不同培養(yǎng)方式、不同蔗糖濃度和不同外植體大小對(duì)芋試管球莖的誘導(dǎo)以及球莖膨大的影響.結(jié)果表明,同靜置培養(yǎng)相比,旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)不影響培養(yǎng)30d后試管球莖的鮮重、干重以及球莖的干物質(zhì)含量,而影響培養(yǎng)過(guò)程中養(yǎng)分的吸收.在M

6、S+1mg/16-BA+0.5 mg/1 NAA的液體培養(yǎng)基中添加3﹪、8﹪或12﹪的蔗糖,發(fā)現(xiàn)添加3﹪蔗糖的培養(yǎng)基中沒(méi)有試管球莖產(chǎn)生,8﹪的蔗糖濃度最有利于試管成球,產(chǎn)生的子球數(shù)、球莖的鮮重和干重顯著高于12﹪的蔗糖濃度.在8﹪和12﹪的蔗糖濃度下形成球莖的干物質(zhì)含量沒(méi)有顯著差異.不同大小的外植體影響子球的數(shù)量,2-3cm和4-5cm的試管苗形成的子球數(shù)差異不顯著,而均顯著高于6-7cm試管苗所形成的子球數(shù).隨著試管苗高度的增加,形成

7、的試管球莖的鮮重和干重增加,4-5cm和6-7cm的試管苗形成的試管球莖的鮮重和干重顯著高于2-3cm的試管苗. 茉莉酸類(lèi)化合物有利于一些作物的試管成球以及球莖的膨大.本文研究了不同濃度的茉莉酸甲酯對(duì)芋試管成球過(guò)程中子球數(shù)、鮮重、干重和干物質(zhì)含量以及對(duì)成球過(guò)程中生根的影響,并分析了.MeJA影響芋試管成球的機(jī)理.結(jié)果表明,不同濃度的MeJA處理對(duì)子球數(shù)沒(méi)有顯著影響,而顯著增加試管球莖的干物質(zhì)含量.同對(duì)照相比,0.1和1μM的Me

8、JA對(duì)試管球莖的鮮重沒(méi)有顯著影響,而顯著增加了試管球莖的干重0.5和10μM MeJA處理顯著降低了試管球莖的鮮重和干重.MeJA影響試管成球過(guò)程中根系的產(chǎn)生,隨著處理濃度的增加,根數(shù)減少,根系變短.適宜濃度的MeJA處理對(duì)芋試管成球的影響,可能主要是通過(guò)影響培養(yǎng)物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收以及莖尖中貯藏物質(zhì)的積累,而且MeJA可能主要作用于芋試管球莖的膨大. 球根類(lèi)植物成球過(guò)程中淀粉粒的積累以及質(zhì)體.造粉體系統(tǒng)的分化,是研究碳水化合物合成

9、以及質(zhì)體分化生理機(jī)制的重要前提條件.本文以離體條件下生長(zhǎng)的芋試管苗為材料,主要研究了成球培養(yǎng)不同時(shí)期前質(zhì)體分化為造粉體以及淀粉粒積累的過(guò)程,并觀察和分析了在質(zhì)體分化和淀粉積累過(guò)程中細(xì)胞核和一些細(xì)胞器的變化.觀察結(jié)果表明,在含有8﹪蔗糖的培養(yǎng)基中,質(zhì)體分化,在培養(yǎng)至第4d時(shí),質(zhì)體的基質(zhì)中出現(xiàn)了明顯的片層結(jié)構(gòu),接下來(lái)細(xì)胞質(zhì)液泡化,出現(xiàn)了許多小的液泡.在培養(yǎng)至第8d時(shí),觀察到淀粉粒.淀粉粒積累的位置在片層膜之間.隨著淀粉粒的數(shù)量增多,體積增大

10、,質(zhì)體中的片層膜消失.隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞核在細(xì)胞中所占的比例減少,而液泡的體積增大.最后造粉體逐漸充滿整個(gè)細(xì)胞,液泡的凹陷部位也被造粉體充滿. 雙向電泳是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的關(guān)鍵技術(shù).本研究取在8﹪蔗糖濃度下培養(yǎng)0d、2d、4d、6d、8d的莖尖,采用液氮研磨、4﹪SDS煮沸、10﹪的TCA-丙酮沉淀后再用高濃度的尿素(9,5 MUrea,65mM DTT,4﹪CHAPS,2﹪IPG buffer,1﹪Cocktail)溶解的

11、制樣方法,制得的蛋白樣品用pH 4-7的線性IPG凝膠和12.5﹪的聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)分離,得到了高分辨率的2-D膠.采用ImageMaster5.0對(duì)得到的結(jié)果進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)了13個(gè)差異表達(dá)的蛋白.采用質(zhì)譜分析的辦法,成功鑒定了4個(gè)在球莖誘導(dǎo)和發(fā)育過(guò)程中特異表達(dá)的蛋白.其中點(diǎn)1在0d低表達(dá),而從第2d開(kāi)始表達(dá)量升高,電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)鑒定為細(xì)胞質(zhì)中的3-磷酸甘油醛脫氫酶.點(diǎn)2從第4d開(kāi)始出現(xiàn),第6d的表達(dá)量