γδT細(xì)胞在細(xì)粒棘球蚴感染中作用的初步研究.pdf

1、目的:通過(guò)研究包蟲病患者以及小鼠感染模型中γδT淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)，探討γδT淋巴細(xì)胞在包蟲感染免疫作用機(jī)制，為進(jìn)一步探討抗包蟲病的免疫機(jī)制和包蟲病的防治提供新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　方法:（一）檢測(cè)包蟲病患者中γδT細(xì)胞的變化:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)包蟲病患者和正常人γδT細(xì)胞數(shù)目和比例；流式分選γδT細(xì)胞并用anti-TCRγδ+IL-2刺激后觀察γδT細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)；純化得到的rEg14-3-3進(jìn)行SDS-PAGE電泳；對(duì)純化獲得的rEg

2、14-3-3進(jìn)行western blot鑒定；MTT法和流式檢測(cè)不同抗原（囊液，囊壁，原頭蚴，rEg14-3-3）刺激γδT細(xì)胞增殖能力；ELISA檢測(cè)不同抗原（囊液，囊壁，原頭蚴，rEg14-3-3）刺激慢性包蟲病患者和正常人γδT細(xì)胞后IFN-γ，TNF-α，IL17A，TGF-β和IL-4細(xì)胞因子的表達(dá)；qRT-PCR檢測(cè)IFN-γ，Perforin，Granzyme A and B,和FasL mRNA的表達(dá)。
　　（二）

3、檢測(cè)小鼠繼發(fā)感染模型中γδT細(xì)胞的變化：從包蟲病手術(shù)患者包囊中分離原頭蚴，經(jīng)腹腔注射感染BALB/c小鼠；建立細(xì)粒棘球蚴繼發(fā)感染動(dòng)物模型；感染模型小鼠中小腸組織IEL淋巴細(xì)胞的分離，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)IEL+γδT細(xì)胞數(shù)量及表型。
　　結(jié)果:細(xì)粒棘球蚴感染人后??T細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果:從健康人與病人外周血中分離PBMCs，通過(guò)流式檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，病人外周血中??T細(xì)胞無(wú)論從絕對(duì)數(shù)量還是從比例以及V?2亞型都明顯下降（有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）經(jīng)流分選出??T

4、細(xì)胞后，加入anti-TCRγδ+IL-2可促進(jìn)其體外擴(kuò)增；對(duì)體外擴(kuò)增的??T細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，??T細(xì)胞對(duì)原頭蚴粗抗原刺激能夠產(chǎn)生明顯的增殖活化，而對(duì)囊液、囊壁以及重組抗原14-3-3無(wú)應(yīng)答（P<0.01）；對(duì)于經(jīng)不同成分刺激后，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)對(duì)于原頭蚴刺激??T細(xì)胞細(xì)胞因子IFN-?與TNF-α顯著的升高（P<0.01）；T細(xì)胞在原頭蚴抗原刺激后，細(xì)胞毒作用分子（穿孔素，顆粒酶A和B，IFN-γ和FasL）的mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)，有統(tǒng)

5、計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　小鼠繼發(fā)感染細(xì)粒棘球蚴模型中??T細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果:原頭蚴腹腔感染的模型小鼠建立成功；IEL細(xì)胞數(shù)量明顯減少（P<0.05）；小腸IEL+γδT細(xì)胞也明顯減少（P<0.05）。
　　結(jié)論:體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在細(xì)粒棘球蚴患者中，原頭蚴粗抗原可有效誘導(dǎo)外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中γδT細(xì)胞擴(kuò)增，其主要效應(yīng)分子IFN-γ的mRNA表達(dá)及分泌明顯增高，另外原頭蚴粗抗原可刺激穿孔素，顆粒酶A和B，F(xiàn)asL的m