CpG佐劑對羊細粒棘球蚴Eg95抗原的免疫增強作用研究.pdf

1、細菌基因組DNA中存在具有免疫學刺激活性、以未甲基化胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸為核心的脫氧核苷酸序列，即CpG基序（CpG motif）。CpG ODN是指含有CpG基序的寡脫氧核苷酸。CpG ODN通過與胞內(nèi)受體的TLR9結合，活化pDC細胞、B淋巴細胞、單核細胞等多種免疫細胞，可以作為一種潛在免疫增強劑，激活固有免疫應答，促進免疫細胞分泌產(chǎn)生IL-12、TNF-α、IFN-α/β和IFN-γ等細胞因子，促進Th1型適應性免疫反應。人工合成

2、的含有5’-GACGTT-3’堿基序列的CpG ODN對小鼠免疫系統(tǒng)具有強烈的免疫刺激作用。pUC18-CpG質(zhì)粒則是將含有10拷貝GACGTT的CpG基序克隆至pUC18載體中構建而成，由本實驗室保存。
　　將人工合成的CpG ODN和pUC18-CpG質(zhì)粒分別刺激RAW264.7細胞，提取總RNA。以反轉錄的cDNA為模板，采用實時熒光定量PCR方法檢測細胞因子和干擾素（IFN-β、IFN-γ、IL-1β、TNF-α、IL-1

3、2p40）的相對表達量。結果顯示，在CpG ODN或pUC18-CpG刺激下，除IFN-γ外， IFN-β、IL-1β、TNF-α、IL-12p40的相對表達量分別達到了17.22±1.33、64.56±3.87、4.45±0.25、79.50±4.87和11.17±1.34、10.61±0.69、5.56±0.41、51.17±2.56，差異顯著（P<0.05）；除 TNF-α外，CpG ODN刺激IFN-β、IL-12p40和IL-

4、1β相對表達量較pUC18-CpG刺激表達量差異更顯著（P<0.05）。
　　重組pET-32a-3Eg95大腸桿菌經(jīng)IPTG誘導表達，親和層析純化出重組蛋白3Eg95。重組蛋白分別與常規(guī)佐劑Quli-A、pUC18-CpG和CpG ODN配伍后，免疫小鼠。通過間接ELISA方法監(jiān)測各組抗體效價平均水平，采用實時熒光定量 PCR方法測定體外刺激實驗后細胞因子的相對表達量。結果顯示，pUC18-CpG組和CpG ODN組小鼠免疫后1

5、4天、28天以及42天ELISA抗體平均水平（OD450nm）分別為3.10±0.07、3.03±0.15、3.22±0.05和2.98±0.10、3.12±0.06、3.27±0.33，與 Quli-A組抗體平均水平相比均差異均顯著(P<0.05)；CpG ODN組抗體平均水平略高于pUC18-CpG組，但差異不顯著（P≥0.05）。體外制備小鼠脾臟淋巴細胞，經(jīng)重組蛋白刺激后， pUC18-CpG組與 CpG ODN組細胞 IFN-β

6、、IFN-γ和 TNF-α的相對表達量分別為6.88±0.32、2.35±0.45、6.28±0.21和5.03±0.50、2.85±0.18、7.07±1.01，與Quli-A組相比差異均顯著(P<0.05)。
　　因此，在細胞免疫水平方面，pUC18-CpG和CpG ODN均能上調(diào)I型IFN和促炎性因子的表達，具有誘導Th1型免疫反應的特性；相對于常規(guī)佐劑Quli-A，pUC18-CpG和CpG ODN在體液免疫和細胞免疫方面