中國華東葡萄抗白粉病新基因原核表達與抗體制備.pdf

1、葡萄白粉病是由葡萄白粉病菌[Uncinulanecator(Schw.)Burr.]引起的一種世界性的真菌病害。中國是葡萄屬植物最重要的原產(chǎn)地之一，中國野生葡萄蘊藏豐富的抗病種質(zhì)資源。本實驗室研究人員通過mRNA差異顯示技術(shù)(mRNAdifferentialdisplayreversetranscription-PCR，DDRT-PCR)及cDNA末端快速擴增技術(shù)(RapidamplificationofcDNAends，RACE)，從

2、高抗白粉病的華東葡萄白河-35-1(Vitispseudoreticulata)中克隆分離得到一條抗白粉病相關(guān)的新基因GLOXrg的cDNA全長序列。 本研究利用生物信息學的常用工具及軟件初步分析預測了該基因編碼蛋白的功能及理化性質(zhì)，將該新基因構(gòu)建原核融合表達載體，運用體外表達技術(shù)獲得其體外表達產(chǎn)物融合蛋白，并對其進行了純化研究，為該基因體外功能的進一步驗證提供依據(jù)。同時將獲得的融合蛋白作抗原制備多克隆抗體，為目的基因產(chǎn)物在植株

3、體內(nèi)的定位研究、表達量的時空變化研究以及轉(zhuǎn)基因植物的篩選和檢測奠定基礎(chǔ)。取得的主要結(jié)果如下： 1新基因GLOXrg編碼蛋白的物理化學性質(zhì)與功能預測結(jié)果顯示，其可能是一個定位于細胞膜上的催化醛類的氧化而產(chǎn)生H2O2的乙二醛氧化酶，但其編碼蛋白的分子量56kDa比已知真菌上乙二醛氧化酶分子量68kDa小。通過對H2O2抗病作用的分析，GLOXrg基因可能在葡萄抗白粉病的過程中起著重要的作用。 2根據(jù)已知中國野生葡萄抗白粉病相

4、關(guān)新基因GLOXrg基因序列，設(shè)計一對特異PCR引物，通過PCR方法，以華東葡萄白河-35-1(V.pseudoreticulata)5'RACEcDNA第一鏈為模板，擴增出一條約1572bp的DNA條帶，經(jīng)克隆測序，結(jié)果顯示所獲片段含有實際大小為1572bp的完整閱讀框，與已知中國野生葡萄GLOXrg基因序列完全一致。將目的基因分別構(gòu)建重組原核表達載體pGEX-GLOXrg，經(jīng)雙酶切鑒定，目的基因與表達載體均正確連接，重組表達載體構(gòu)建

5、成功。 3重組原核表達載體pGEX-GLOXrg轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coliBL21(codenplus)中，經(jīng)誘導培養(yǎng)后，重組菌特異性表達了在SDS-PAGE上顯示大小為83kDa的融合蛋白，說明GLOXrg基因全長在E.coliBL21(codenplus)中得到表達。通過誘導劑IPTG不同濃度誘導對照、不同誘導培養(yǎng)時間對照以及不同誘導培養(yǎng)溫度對照，確定了最佳表達條件(37℃，0.1mMIPTG誘導表達5h)。 4以包涵

6、體形式表達的GST-GLOXrg融合蛋白能夠通過變性溶解、梯度透析方法復性，復性蛋白經(jīng)GST親和介質(zhì)進行富集，SDS-PAGE結(jié)果顯示獲得了很好的純化蛋白，間接證明目的蛋白經(jīng)重折疊后已恢復或接近天然結(jié)構(gòu)，為進一步的功能驗證等研究提供了依據(jù)。 5.以GS-GLOXrg融合蛋白作為抗原免疫家兔，獲得的多克隆抗血清按1：10000稀釋后，經(jīng)Westernblotting檢測對目的蛋白特異性良好，能夠與GS-GLOXrg融合蛋白產(chǎn)生抗原