水牛泌乳期和非泌乳期miRNAs表達(dá)譜分析及miR-103和Novel-miR-57的靶向基因研究.pdf

1、奶水牛是熱帶亞熱帶地區(qū)重要的產(chǎn)奶動物，水牛奶占世界牛奶供給量的5％以上。水牛奶的乳脂率和乳蛋白含量是荷斯坦奶牛的2.22和1.72倍。因此，研究奶水牛泌乳生理的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可以揭示奶水牛高營養(yǎng)形成的分子機(jī)制。MicroRNAs(miRs)是一類非編碼的19-25nt的小RNA，通過與靶基因mRNA結(jié)合阻遏靶mRNA翻譯或降解靶mRNA來調(diào)控蛋白的表達(dá)。據(jù)估算，30％的蛋白編碼基因受到miR的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)miRs在動物細(xì)胞分化、增殖和凋

2、亡過程中發(fā)揮重要作用。成年動物乳腺組織可以經(jīng)歷細(xì)胞增殖、分化、去分化和凋亡的循環(huán)，是研究乳腺組織泌乳和生理的理想分子機(jī)制模型。對人和小鼠的研究結(jié)果表明人的乳腺特異性miRs有23個，而小鼠的乳腺特異性miRs只有9個，表明miRs在乳腺中發(fā)揮重要作用。目前研究主要是關(guān)于miRs在其他產(chǎn)奶家畜泌乳生理中的作用，水牛的泌乳期和非泌乳乳腺組織miRs表達(dá)譜尚無報導(dǎo)。本研究首次對水牛泌乳期和非泌乳期乳腺組織中miRs的表達(dá)譜和作用進(jìn)行了研究，構(gòu)

3、建了奶水牛泌乳期和非泌乳期乳腺組織的miR表達(dá)譜，分析和驗證了18個miR的差異表達(dá)模式，對篩選出的差異顯著表達(dá)bbu-miR-103和novel-miR-57及其靶向基因和功能進(jìn)行了研究，以便為闡明奶水牛泌乳物質(zhì)及能量代謝通路的分子作用機(jī)制奠定工作基礎(chǔ)。
　　1.水牛泌乳期和非泌乳期乳腺組織miRNA差異表達(dá)譜的構(gòu)建及分析
　　采集水牛泌乳高峰期和非泌乳期（干乳期）的乳腺樣本，利用Solexa高通量測序技術(shù)構(gòu)建了水牛泌乳期

4、以及非泌乳期乳腺組織2個miRNA表達(dá)譜，獲得非泌乳期和泌乳期18nt-31nt的12，569，467和12，768，110條高質(zhì)量序列。統(tǒng)計顯示，中國沼澤型水牛泌乳和非泌乳期的sRNA分布的寬度模式介于18-31nt之間，在22nt達(dá)到一個高峰值，其中泌乳期乳腺組織中22nt序列占總sRNA數(shù)量的33.4％。在miRbase17.0庫中檢測到成熟miRs和pre-miR分別是676個和662個，歸屬500個microRNA基因家族。本

5、研究在水牛乳腺組織測序確認(rèn)的成熟miRs和全部pre-miR分別為359個和363個，歸屬為259個miRs家族;從新發(fā)現(xiàn)的262個候選miR中鑒定出230個水牛新miRs，其中5個是水牛特有的miRs。對所有鑒定的miRNA的第一個核苷酸偏好性分析顯示，U是19nt和25nt miRs的5'端最普遍的核苷酸(94.15％和97.90％)。統(tǒng)計其在染色體上的分布情況，發(fā)現(xiàn)68.77％的已知miR和84.69％的新miR位于常染色體上，成

6、功定位于乳腺組織染色體上的基因間隔區(qū)。已知miR主要分布在21號和X染色體，分別為74和37個占總數(shù)量的635個的11.65％和5.83％。新發(fā)現(xiàn)的miR，在21號和X染色體上分別為38個和32個。總miR分布在常染色體和X染色體上，密度從0.09到1.05 miRs/Mbp不等。21號染色體是miRs主要表達(dá)的染色體，分布最多，總miRs，泌乳期表達(dá)miRs和非泌乳期miRs分別為1.05個/Mbp，1.34個/Mbp和1.35個/M

7、bp。泌乳期和非泌乳期miRs在相同染色體上的分布密度基本相同。
　　2.水牛泌乳期和非泌乳期乳腺組織miRs差異表達(dá)譜分析
　　在非泌乳期，bbu-miR-148a，bbu-let-7b，bbu-let-7a，bbu-miR-21，bbu-miR-143，bbu-miR-200c，bbu-miR-26a，bbu-miR-200a和bbu-let-7f是主要表達(dá)miRs，組成了總已知miRNA序列的53.8％，每個miRs讀

8、數(shù)大于20，000個序列，表明它們是非泌乳期組織中高豐度表達(dá)miRs。在泌乳期發(fā)現(xiàn)有7個高表達(dá)的miRs(bbu-let-7b，bbu-let-7a，bbu-miR-26a, bbu-miR-125b，bbu-miR-21，bbu-miR-29a和bbu-let-7c)，每個有20，000多條序列表達(dá)。比較兩個樣品組，bbu-miR-148a，bbu-miR-143，bbu-miR-200a，bbu-miR-141和bbu-miR-30

9、a-5p等這些miRs在泌乳期的表達(dá)量下降到非泌乳期的一半以下。而另外一些miR，如bbu-miR-26a，bbu-miR-29a，bbu-miR-125b，bbu-let-7c and bbu-miR-99a在泌乳期比非泌乳期表現(xiàn)出多余或等于2倍序列豐度。根據(jù)KEGG對20個差異高表達(dá)miRNA的預(yù)測靶基因進(jìn)行了功能分類。結(jié)果109個預(yù)測靶基因都被標(biāo)記在MAPK信號通路，其他重要途徑有Jak-STAT、催乳素(PRL)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和胰島素

10、信號通路等。
　　3.泌乳期和非泌乳期差異表達(dá)miRNAs篩選及QRT-PCR驗證
　　差異分析兩個時期miRs的表達(dá)譜，篩選出18個miRs并運用QRT-PCR對其表達(dá)量進(jìn)行驗證。將其分為高豐度、低豐度和未知miRs:(a)9個高表達(dá)的已知的miR:bbu-miR-30a-5p, bbu-miR-141, bbu-miR-101, bbu-miR-103, bbu-miR-148a, bbu-miR-29a，bbu-miR

11、-125b，bbu-miR-497和bbu-miR-125a;(b)4個低豐度表達(dá)的miR: bbu-miR-490，bbu-miR-217，bbu-miR-592和bbu-miR-2370*;(c)5個高表達(dá)的未知miR:novel-miR-57，novel-39，novel-148，novel-76和novel-123b。QRT-PCR驗證結(jié)果顯示，bbu-miR-103，bbu-miR-125a、bbu-miR-30a-5p和bb

12、u-miR-148a在泌乳期表達(dá)量高于非泌乳期，其表達(dá)量分別為非泌乳期的2.43、3.43、4.06和5.29倍(P＜0.05);bbu-miR-29a在非泌乳期表達(dá)量為泌乳期的0.3倍，顯著低于泌乳期(P＜0.05);bbu-miR-141，bbu-miR-125b，bbu-miR-497和bbu-miR-101的表達(dá)量在泌乳期高于非泌乳期，但差異不顯著(P＞0.05)。低豐度的miR-490和miR-592在泌乳期表達(dá)量分別為非泌乳

13、期的4.96和3.82倍，差異顯著(P＜0.05)。在高豐度表達(dá)的5個的未知miRNA中，novel-39，novel-148，novel-76和novel-123b在泌乳期和非泌乳期差異不顯著(P＞0.05)，Novel-miR-57在泌乳期比非泌乳期高29.79倍(P＜0.05)。因此，選擇miR-103和novel-miR-57作為下一步主要研究對象。
　　4.Bbu-miR-103靶向基因PANK3調(diào)控乳脂代謝的研究

14、>　　基于人免疫缺陷慢病毒系統(tǒng)的載體骨架，構(gòu)建了LPEZX-PRE-MIR-103-1前體表達(dá)克隆載體(8219 bp)，攜帶Bbu-miR-103前體序列。將LPEZX-PRE-MIR-103-1與對空載體LPEZX-MIR-NC分別與NRF和VSVG在293T細(xì)胞中進(jìn)行包裝和擴(kuò)繁，獲得了感染滴度分別為3.42×106 PFU/mL和3.47×106pFU/mL的復(fù)制缺陷型病毒。用組織塊法培養(yǎng)了乳腺上皮細(xì)胞，用等量對照和miR-103

15、病毒原液感染乳腺上皮細(xì)胞48 h后，在顯微鏡下觀察有綠色熒光蛋白發(fā)光，表明miR-103及空載對照病毒顆粒已經(jīng)成功地進(jìn)入了水牛乳腺上皮細(xì)胞中，代謝產(chǎn)生了過量miR-103。同時化學(xué)法合成miR抑制劑并進(jìn)行轉(zhuǎn)染試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)和抑制表達(dá)miR-103與乳腺細(xì)胞靶基因PANK3表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。因此，推測PANK3是水牛miR-103作用的靶基因。過表達(dá)miR-103，下調(diào)了PANK3的表達(dá)，顯著提高了SREBP1c和ACACA的表達(dá)。測

16、定了過表達(dá)miR-103載體對水牛脂肪代謝通路8個關(guān)鍵的步驟相關(guān)基因的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，bbu-miR-103主要作用基因范圍從脂肪酸從頭合成開始、延伸至甘油三酯合成、乳脂合成和分泌以及脂肪酸吸收為止，對乳脂后續(xù)的轉(zhuǎn)運代謝無較大影響。
　　5.Novel-miR-57在Bcap-37和水牛乳腺上皮細(xì)胞上的靶基因—DOK4的狩獵及驗證
　　Novel-miR-57是在泌乳期和非泌乳期乳腺組織中篩選出的相對表達(dá)量差異最大的新發(fā)現(xiàn)m

17、iR，但在miRBase數(shù)據(jù)庫檢索不到類似或同族的miR。為此，我們運用MiRscan對Novel-miR-57的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測。結(jié)果顯示，Novel-miR-57可能有8個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，結(jié)合自由能為-28.0kcal/mol，Novel-miR-57的成熟序列位于miR的第一個莖環(huán)上。使用自編軟件ensembl(v80)注釋mRNA截取3'UTR，篩選結(jié)合自由能小于-20kcal/mol的mRNA3'UTR與miR成熟序列的5'端的2

18、-8種子序列進(jìn)行配對，找到34個水牛轉(zhuǎn)錄組mRNA可能是Novel-miR-57的作用靶基因。這些基因包括CYP7B1、CACNG3、DOK4、COL17A1、和ESN1等基因，對這些基因進(jìn)行了GO assignment和KEGG信號通路預(yù)測分析。用水牛泌乳和非泌乳期乳腺組織cDNA添加線蟲miR-39作為外參進(jìn)行QRT-PCR定量分析，尋找差異表達(dá)靶基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有6個基因檢測不到，RCL1、UBE3C和NFRKB等10個基因在非泌乳

19、期和泌乳期相對表達(dá)量相似或高于泌乳期;BRMS1L、ACTL8和ADORO等11個基因在泌乳期和非泌乳期相對表達(dá)量相似或高于非泌乳期;DLX3、CANCNG3、NFKBID、C17orf53、RTN1和FBXO10等7個基因在非泌乳期表達(dá)量遠(yuǎn)高于泌乳期，分別為128.03、144.23、146.24、160.96、160.38、274.40和326.24倍，差異極顯著(P＜0.01)，可能為主要靶基因?；瘜W(xué)合成Novel-miR-57的

20、類似物Mimics和抑制劑Inhibitor，探討Novel-miR-57的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Bcap-37細(xì)胞系添加Novel-miR-57后能顯著抑制DOK4基因的表達(dá)(P＜0.01)，而Inhibitor能顯著提高DOK4基因的表達(dá)(P＜0.01);而在水牛乳腺細(xì)胞添加100nM的Novel-miR-57后能顯著促進(jìn)DOK4基因的表達(dá)(P＜0.01)，添加200nM的Inhibitor能顯著抑制DOK4基因的表達(dá)(P＜0.01)，與

21、對Bcap-37細(xì)胞的作用相反。揭示了DOK4是Novel-miR-57的作用靶基因，且Novel-miR-57能夠根據(jù)不同細(xì)胞系不同生理條件來上調(diào)和下調(diào)DOK4基因的表達(dá)，最終對泌乳新陳代謝通路產(chǎn)生作用。
　　結(jié)論:高差異表達(dá)Bbu-miR-103在水牛乳腺組織中的靶基因是PANK3。Bbu-miR-103通過從頭合成途徑促進(jìn)脂肪酸合成，對水牛乳腺上皮細(xì)胞的甘油三脂合成、乳脂滴合成和分泌、脂肪酸激活等3個乳脂代謝步驟有促進(jìn)作用。