CRM197和順鉑聯(lián)合應(yīng)用對膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的作用及其機(jī)制初探.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是最為常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)腫瘤,據(jù)統(tǒng)計我困腦膠質(zhì)瘤占顱內(nèi)腫瘤的35.2％-61.0％,平均49.7％。化學(xué)治療作為膠質(zhì)瘤治療的重要補(bǔ)充,其地位已經(jīng)明確并得到肯定。
　　 交叉反應(yīng)物質(zhì)197(cross-reacting materia1197,CRM197)是白喉毒素突變體中的一種,喪失毒性的同時仍保留白喉毒素的免疫原性,它們均可以與細(xì)胞膜上的白喉毒素受體(diphtheria toxin receptor,DTR),

2、也稱肝素結(jié)合表皮生長因子的膜結(jié)合前體(pro heparin-binding epidermal growth factor,pro HB-EGF)結(jié)合。本實驗室前期研究證實DTR在人腦膠質(zhì)瘤中表達(dá),且其表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤病理級別呈顯著正相關(guān)關(guān)系。從20世紀(jì)80年代中期起,CRM197就作為載體蛋白應(yīng)用于人類疫苗的接種。最近研究發(fā)現(xiàn),CRM197能夠作為轉(zhuǎn)運載體,轉(zhuǎn)運大分子的辣根過氧化物酶通過血腦屏障(blood brain barrie

3、r,BBB),目前認(rèn)為其機(jī)制主要是CRM197與DTR結(jié)合后,通過受體介導(dǎo)的胞吞轉(zhuǎn)運通過BBB。研究證實,CRM197具有抗腫瘤作用,但CRM197對膠質(zhì)瘤的作用尚未見報道,其與傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合應(yīng)用可能成為膠質(zhì)瘤治療的新途徑。
　　 P13K/Akt信號通路在腫瘤的增殖、凋亡、血管發(fā)生以及細(xì)胞運動中發(fā)揮著重要作用。P13K/Akt信號通路被激活,抵抗細(xì)胞凋亡,促進(jìn)腫瘤生長。順鉑是治療膠質(zhì)瘤的常用化療藥物,但易產(chǎn)生耐藥性,限制了其

4、在臨床上的應(yīng)用。實驗研究證明,順鉑作用于腫瘤細(xì)胞,可以激活P13K/Akt信號通路,抑制細(xì)胞凋亡,而CRM197可以抑制P13K/Akt信號通路的激活。CRM197和順鉑聯(lián)合應(yīng)用,CRM197是否可以通過抑制順鉑引起的P13K/Akt信號通路的激活,提高膠質(zhì)瘤對順鉑的敏感性而提高化療效果,為治療腦膠質(zhì)瘤提供新途徑足本實驗的研究宗旨。
　　 材料和方法：
　　 一、實驗材料
　　 (一)實驗細(xì)胞株U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞

5、株由中國醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物重點實驗室提供。
　　 (二)主要試劑CRM197,順鉑,MTT,DMSO,LY294002,Wortmannin(美國Sigma公司),DMEM/F-12培養(yǎng)基(美國HyClone公司);胎牛血清(天津灝洋生物科技有限公司);AnnexinV/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒,細(xì)胞凋亡線粒體膜電位檢測試劑盒(南京凱基生物科技有限公司);羊抗Aktl/2多克隆抗體,兔抗p-Aktl/2/3(Ser473)多克隆抗體

6、,小鼠抗β-actin單克隆抗體,增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法試劑盒(美國Santa Cruz公司);兔抗山羊HRP標(biāo)記的IgG二抗,山羊抗兔HRP標(biāo)記的IgG二抗,山羊抗小鼠HRP標(biāo)記的IgG二抗(北京中山生物技術(shù)公司)。
　　 (三)主要儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Forma scientific公司);超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);倒置顯微鏡(同本TMS公司);紫外一可見光分光光度計(日本島津公司);BDFACSCalibur流式細(xì)胞

7、儀(美國Becton-Dickinson公司);超聲粉碎機(jī)(德國Dr.Hielscher公司);臺式低溫超速離心機(jī)(德國Sigma公司);聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置(美國Bio-Rad公司);轉(zhuǎn)印儀(北京市六一儀器廠);Las3000成像系統(tǒng)(日本FUJIFILM公司);凝膠成像分析軟件(江蘇捷達(dá)科技有限公司);電子分析天平(德國Sartofius公司);-80℃超低溫冰箱(日本SANYO公司);恒溫震蕩水浴(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公

8、司);旋渦混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)。
　　 二、實驗方法：
　　 (一)細(xì)胞培養(yǎng)
　　 (二)藥物濃度設(shè)計及分組1、(1)對照組(2)順鉑(51ug/m1)組(3)CRM197(1ug/m1)組(4)順鉑(51ug/m1)+CRM197(1ug/m1)組
　　 2、(1)對照組(2)LY294002(10um/1)組(3)Wortmannin(1um/1)組(4)順鉑(5ug/m1)+CRM197(1

9、ug/m1)組(5)順鉑(5ugm1)+CRM197(1um/ml)+LY294002(1Oum/1)組(6)順鉑(51ug/m1)+CRM197(1ug/m1)+Wortmannin(1um/1)組
　　 (三)細(xì)胞生長抑制實驗(MTT比色法)
　　 (四)細(xì)胞凋亡Annexin V-FITC/PI檢測
　　 (五)細(xì)胞凋亡線粒體膜電位檢測(JC-1)
　　 (六)Western blot方法檢測Akt

10、及p-Akt蛋白的變化
　　 (七)統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)值以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)表示,采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,組問比較采用單因素方差分析(Bonferroni檢驗),P　　 實驗結(jié)果：
　　 一、MTT方法檢測藥物作用不同時間后對U251細(xì)胞生長的影響順鉑,CRM197,順鉑+CRM197作用U251細(xì)胞0h,3h,6h,12h,24h,48h后,應(yīng)用MTT

11、方法檢測各組藥物對U251細(xì)胞生長的影響。順鉑,順鉑+CRM197以時間依賴方式抑制細(xì)胞生長;CRM197對細(xì)胞生長的抑制作用在24h達(dá)到峰值,之后下降。與同時間點順鉑或CRM197組相比,順鉑+CRM197顯著抑制細(xì)胞生長,但順鉑+CRM197作用48h與同時間點順鉑組相比則沒有顯著差異。因此,在后續(xù)試驗中選擇24h作為最長給藥時間。
　　 二、Annexin V-FITC/PI染色方法檢測藥物作用24h后對U251細(xì)胞凋亡的

12、影響
　　 順鉑,CRM197,順鉑+CRM197作用U251細(xì)胞24h后,應(yīng)用Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記法檢測細(xì)胞凋亡。對照組,順鉑組,CRM197組,順鉑+CRM197組的凋亡率(含壞死細(xì)胞)分別是4.73±2.13％,34.61±4.23％,18.88±3.66％,43.62±3.03％。與對照組相比,順鉑,CRM197,順鉑+CRM197顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;與順鉑或CRM197組相比,順鉑+CRM197顯著誘

13、導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　 三、線粒體膜電位JC-1染色方法檢測藥物作用24h后對U251細(xì)胞凋亡的影響
　　 順鉑,CRM197,順鉑+CRM197作用U251細(xì)胞24h后,應(yīng)用線粒體膜電位Jc-1染色方法檢測細(xì)胞凋亡。對照組,順鉑組,CRM197組,順鉑+CRM197組的凋亡率分別是6.83±1.91％,38.22±3.82％,20.78±3.22％,44.03±3.63％。與對照組相比,順鉑,CRM197,順鉑+CRM19

14、7顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;與順鉑或CRM197組相比,順鉑+CRM197顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　 四、Western blot方法檢測藥物對U251細(xì)胞P-Akt及Akt蛋白表達(dá)水平的影響
　　 順鉑,CRM197,順鉑+CRM4197作用U251細(xì)胞Oh,3h,6h,12h,24h后,應(yīng)用Westernblot方法檢測p-Akt及Akt蛋白的表達(dá)。順鉑上調(diào)p-Akt蛋白的表達(dá);CRM197下調(diào)p-Akt蛋白的表達(dá);順鉑+CR

15、M197下調(diào)P-Akt蛋白的表達(dá),12h達(dá)到最低值,持續(xù)至24h。順鉑,CRM197,順鉑+CRM197作用U251細(xì)胞24h后,應(yīng)用Westernblot方法檢測p-Akt及Akt蛋白的表達(dá)。與對照組相比,順鉑顯著上調(diào)p-Akt蛋白的表達(dá),而CRM197,順鉑+CRM197顯著下調(diào)p-Akt蛋白的表達(dá);與順鉑組相比,順鉑+CRM197顯著下調(diào)P-Akt蛋白的表達(dá)。
　　 五、MTT方法檢測藥物作用24h后對U251細(xì)胞生長的影

16、響LY294002,Wortmannin,順鉑+CRM197,順鉑+CRM197+LY294002,順鉑+CRM197+Wortmannin作用U251細(xì)胞24h后,應(yīng)用MTT方法檢測各組藥物對U251細(xì)胞生長的影響。與順鉑+CRM197組相比,順鉑+CRM197+LY294002或Wortmannin顯著抑制細(xì)胞生長。
　　 六、Annexin V-FITC/PI染色方法檢測藥物作用24h后對U251細(xì)胞凋亡的影響LY2940

17、02,Wortmannin,順鉑+CRM197,順鉑+CRM197+LY294002,順鉑+CRM197+Wortmannin作用U251細(xì)胞24h后,應(yīng)用Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記法檢測細(xì)胞凋亡。對照組,LY294002,Wortmannin,順鉑+CRM197,順鉑+CRM197+LY294002,順鉑+CRM197+Wortmannin組的凋亡率(含壞死細(xì)胞)分別是5.474±2.28％,20.874±3.40％,1

18、8.31±3.68％,45.964±4.69％,64.384±4.30％,68.75±4.52％。與對照組相比,LY294002,Wortmannin,順鉑+CRM197,順鉑+CRM197+LY294002或Wortmannin顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡:與順鉑+CRM197相比,順鉑+CRM197+LY294002或Wortmannin顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　 七、Western blot方法檢測藥物作用24h后對U251細(xì)胞p-Ak

19、t及Akt蛋白表達(dá)水平的影響LY294002,Wortmannin,順鉑+CRM197,順鉑+CRM197+LY294002,順鉑+CRM197+Wortmannin作用U251細(xì)胞24h后,應(yīng)用Western blot方法檢測p-Akt及Akt蛋白的表達(dá)。與對照組相比LY294002,Wortmannin,順鉑+CRM197,順鉑+CRM197+LY294002或Wortmannin顯著下調(diào)p-Akt蛋白的表達(dá);與順鉑+CRM197組