黑線倉鼠白化突變系白化性狀產(chǎn)生機(jī)理的研究.pdf

1、黑線倉鼠白化突變系(A:CHA)的培育在國內(nèi)外都屬首次,本品系的育成為醫(yī)學(xué)生物學(xué)提供了新的動物模型,也是我國為國際實驗動物領(lǐng)域增添的一個新型品系,具有較高的學(xué)術(shù)價值。黑線倉鼠白化突變系(A:CHA)建立后顯示出比黑線倉鼠更好的應(yīng)用前景,在皮膚微循環(huán)、輻射防護(hù)、體表寄生蟲以及流行病學(xué)等應(yīng)用方面,都表現(xiàn)出較黑線倉鼠更多的優(yōu)越性。目前只知道黑線倉鼠白化突變系的基因遺傳屬于單一隱性遺傳,但并不清楚黑線倉鼠白化性狀發(fā)生的原因,因此非常有必要揭示黑

2、線倉鼠白化突變?nèi)喊谆誀畎l(fā)生機(jī)理,弄清楚該突變種群的遺傳背景,進(jìn)一步完善白化黑線倉鼠突變?nèi)旱幕A(chǔ)生物學(xué)數(shù)據(jù),為其在生物醫(yī)學(xué)中的推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本研究以黑線倉鼠與白化突變系皮膚組織為研究對象,利用組織學(xué)、分子生物學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)等方法,對黑線倉鼠與白化突變系的皮膚組織進(jìn)行比較研究,綜合探討了黑線倉鼠與其白化突變系皮膚組織組織學(xué)與分子水平的差異。主要研究內(nèi)容包括黑線倉鼠及其白化突變系毛囊中黑色素細(xì)胞的組織學(xué)分析,皮膚組織黑色素細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的比

3、較分析,皮膚組織白化相關(guān)基因的克隆與生物信息學(xué)分析,白化相關(guān)基因的表達(dá)量比較分析以及基于Illumina測序技術(shù)對黑線倉鼠與白化突變系皮膚組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序和分析。現(xiàn)將實驗研究報告如下:
　　1.黑線倉鼠及其白化突變系毛囊中黑色素細(xì)胞的組織學(xué)分析
　　本研究采用多巴染色來顯示黑色素細(xì)胞,結(jié)果表明,黑線倉鼠與白化突變系的毛囊組織中均有多巴的陽性著色,多巴陽性著色顯示的是成熟的黑色素細(xì)胞,說明在黑線倉鼠與白化突變系毛囊組織中都有

4、成熟黑色素細(xì)胞分布,但分布數(shù)量不同。黑線倉鼠的多巴反應(yīng)陽性區(qū)要明顯高于白化突變系。多巴陽性區(qū)間接反應(yīng)酪氨酸酶(TYR)的活性,說明白化突變系TYR表達(dá)水平顯著低于黑線倉鼠。多巴-甲苯胺藍(lán)復(fù)染充分顯示多巴陽性黑色素在毛囊組織中的分布,黑線倉鼠與白化突變系毛囊組織中黑色素細(xì)胞主要存在于毛囊的毛乳頭中。
　　2.黑線倉鼠與白化突變系皮膚黑色素細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)分析
　?、藕诰€倉鼠的黑色素含量顯著高于白化突變系?？梢?皮膚組織中黑色素的

5、缺乏是導(dǎo)致黑線倉鼠白化突變系發(fā)生的直接原因。
　?、葡鄬τ诤诰€倉鼠,白化突變系皮膚組織的黑色素細(xì)胞明顯較少,黑色素細(xì)胞中黑色素體的發(fā)育程度低,大多黑色素體為未有黑色素沉積的黑色素前體(pre-melanosome),黑色素細(xì)胞中黑色素體的密度明顯較小?？梢?成熟黑色素細(xì)胞的缺乏以及黑色素體中黑色素沉積的缺乏是黑線倉鼠白化發(fā)生的組織學(xué)特征。
　　3.黑線倉鼠與白化突變系白化相關(guān)基因的克隆與序列分析
　　本實驗通過對黑線倉

6、鼠及其白化突變系的白化相關(guān)基因TYR、TYRP1、TYRP2、P、MITF、Agouti基因進(jìn)行克隆與序列分析,明確黑線倉鼠白化突變系白化性狀產(chǎn)生是否是由于上述基因發(fā)生突變所致,結(jié)果首次克隆得到了黑線倉鼠及其白化突變系白化相關(guān)基因TYR、TYRP1、TYRP2、P、MITF、Agouti基因完整的編碼區(qū)序列,但對其基因編碼區(qū)進(jìn)行生物信息學(xué)分析并未發(fā)現(xiàn)突變位點,其白化性狀產(chǎn)生的機(jī)理與已發(fā)現(xiàn)的白化機(jī)制不同,還有待進(jìn)一步的研究。
　　4

7、.黑線倉鼠及其白化突變系白化相關(guān)基因表達(dá)水平比較分析
　　本研究結(jié)果表明TYR、TYRP1、TYRP2、P、MITF、AgoutimRNA表達(dá)量在黑線倉鼠中是白化突變系的2.5、5.3、1.12、1.7、1.8、1.7倍,結(jié)論提示TYR、TYRP1、P、MITF、Agouti的基因表達(dá)量與黑線倉鼠白化突變性狀的產(chǎn)生存在一定的相關(guān)性,本研究為闡明白化相關(guān)基因在色素沉著過程中的調(diào)控機(jī)制,以及黑線倉鼠白化突變系白化性狀產(chǎn)生機(jī)理奠定了一定

8、的理論基礎(chǔ)。
　　5.基于Illumina測序技術(shù)對黑線倉鼠及其白化突變系皮膚組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序和分析
　　本研究以黑線倉鼠與白化突變系皮膚組織為研究對象,應(yīng)用Illumina/Solexa高通量測序技術(shù)對其轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行深度測序,使用短序列組裝軟件SOAP denovo對其轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進(jìn)行從頭組裝(Denovo),建立轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,并與蛋白數(shù)據(jù)庫Nr、Swiss-Prot、KEGG和COG進(jìn)行序列比對、功能注釋及代謝通路分析

9、;在此基礎(chǔ)上,進(jìn)行差異表達(dá)基因分析,篩選與色素合成相關(guān)的基因,對白化機(jī)制進(jìn)行探究。
　　通過本研究共獲得7千多萬條高質(zhì)量配對短序列,通過序列組裝共獲得52,439條Unigenes。通過對黑線倉鼠與白化突變系皮膚轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行差異表達(dá)基因分析,共篩選出6788條差異表達(dá)基因(︱log2Ratio︱≥1且FDR≤0.001),其中表達(dá)上調(diào)5476條,表達(dá)下調(diào)1312條,通過GO功能富集分析及KEGG通路富集分析,這些差異表達(dá)基因主要參與