水胺硫磷對東亞飛蝗的對映選擇毒性及其機制研究.pdf

1、手性是指化學物質(zhì)與其鏡像分子的不重疊特性，是生物學領(lǐng)域被廣泛認知的一個現(xiàn)象。手性物質(zhì)的各對映異構(gòu)體常常有較大的生物活性區(qū)別。有機磷農(nóng)藥有超過25％的都具有對映體選擇性。東亞飛蝗（Locusta migratoria(Meyen)）是主要的世界性害蟲之一，對禾本科以及莎草科的威脅很大。飛蝗的防治工作目前主要以噴灑有機磷等殺蟲劑的傳統(tǒng)化學防治方法為主，隨著農(nóng)藥的多年施用，引起了飛蝗的抗藥性，進而導致施藥量的增加、抗蟲成本破壞的提升以及土壤水

2、體環(huán)境的破壞。
　　通過對水胺硫磷(ICP)混旋體的手性拆分，進行飛蝗半致死量LD50的確定。比較ICP各對映異構(gòu)體影響下，飛蝗羧酸酯酶(CarEs)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)和乙酰膽堿酯酶(AChE)的相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平、各組蟲體酶活性測定以及對照組體外酶敏感性的差異，探究造成ICP對映體在東亞飛蝗體內(nèi)毒性差異的機理。HPLC法（Chiracel OD，正己烷/異丙醇=90/10，25℃，0.8 mL·min-1，230n

3、m）對混旋ICP進行手性拆分。取東亞飛蝗3齡若蟲為試驗材料，用丙酮將ICP對映體分別配制成5個適當濃度；各濃度組滴加30只，丙酮作為參照。室溫正常飼養(yǎng)24h后，利用SPSS19.0求對映體半致死量 LD50。依據(jù)相關(guān)文獻及飛蝗基因數(shù)據(jù)庫，獲取 CarEs、GSTs和AChE相關(guān)基因序列并設(shè)計引物，利用Real-Time PCR技術(shù)，檢測各實驗組蟲體內(nèi)各酶基因的轉(zhuǎn)錄水平。取蝗蟲組織樣本稱重后，按照1:10(W/V)加入 PBS勻漿，冷凍離

4、心制備酶液；以α-NA、β-NA和α-NB為底物，按照Van Asperen及朱坤炎的方法測定CarEs活性；以還原型谷胱甘肽(GSH)為底物，測定GSTs活性；以ATC為底物，按照Ellman的方法測定AChE活性；用對照組進行CarEs、GSTs和AChE活性體外抑制。(+)/(-)-ICP的半致死量LD50分別為0.609 mg·kg-1蟲重和79.412 mg·kg-1蟲重，毒性差異達到130倍。(+)-ICP滴加后，東亞飛蝗L

5、mCesA4和LmCesA5基因轉(zhuǎn)錄均受到抑制， CarEs酶活性均隨著(+)-ICP濃度增加而被抑制。(-)-ICP滴加后，LmCesA4表達量達到了4.65倍，遠高于LmCesA5。染毒蝗蟲的總酯酶和CarEs活性有手性區(qū)別。體外抑制實驗表明(+)-ICP對 CarEs酯酶分解β-NA時卻出現(xiàn)了極強的抑制。(-)-ICP和低濃度(+)-ICP會隨著農(nóng)藥濃度的上升，引起飛蝗體內(nèi)GSTs活性顯著上升；飛蝗GSTs體外抑制實驗表明，(+)

6、/(-)-ICP濃度的上升都會極顯著引起對照組GSTs活性的下降，(-)-ICP半抑制濃度IC50為(+)-ICP的10.5倍；ICP對映體滴加后，LmGSTs4 和LmGSTt1在(+)-ICP中有顯著更高的表達水平。LmGSTs4、LmGSTs7、LmGSTt1是引起飛蝗對(+)-ICP抗性的主要原因。LmGSTd1、LmGSTs1、LmGSTs3、LmGSTs5、LmGSTs6和LmGSTs7過量表達是引起飛蝗對(-)-

7、ICP抗性的主要原因。Lm-ace1mRNA表達隨各對映體濃度的增加，都經(jīng)歷了先升高后下降的趨勢，提升表達倍數(shù)均在4.4~14.9倍。東亞飛蝗的AChE活性，隨(+)-ICP濃度的增加呈現(xiàn)下降趨勢，隨(-)-ICP濃度的增加呈現(xiàn)上升的趨勢。在AChE體外活性抑制實驗中，隨著(+)/(-)-ICP濃度的增加，ICP對映體對東亞飛蝗 AChE的抑制程度也在逐漸增強，(-)-ICP半抑制濃度IC50為(+)-ICP的10.4倍。
　　研