典型有機(jī)磷和擬除蟲菊酯對PC12細(xì)胞毒性的氧化應(yīng)激機(jī)制及對映體選擇性.pdf

1、近幾年來，一些科研工作者對手性農(nóng)藥的環(huán)境安全性進(jìn)行了研究，并發(fā)現(xiàn)手性農(nóng)藥在環(huán)境歸趨、內(nèi)分泌干擾、生殖毒性以及免疫毒性等方面均具有對映體選擇性。然而，到目前為止對單（一）對映異構(gòu)體引起的毒性作用的分子機(jī)制的研究還比較有限。為了更為準(zhǔn)確地評估手性農(nóng)藥的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)性，有必要開展典型手性農(nóng)藥的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)性評價(jià)，并深入研究對映體選擇性毒性的分子機(jī)制。因此，本文主要以丙溴磷和聯(lián)苯菊酯為手性有機(jī)磷和擬除蟲菊酯的代表，以大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤株(PC12)細(xì)胞作為

2、體外細(xì)胞模型，在細(xì)胞和分子水平上研究由氧化應(yīng)激介導(dǎo)的有機(jī)磷和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥對PC12細(xì)胞的毒性機(jī)制及對映體差異性。研究主要取得以下結(jié)果:
　　 (1)以典型手性擬除蟲菊酯聯(lián)苯菊酯(BF)為研究對象，考察了cis-BF引起PC12細(xì)胞細(xì)胞毒性和氧化應(yīng)激的對映體差異性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)濃度為10-5molL-1及以上時(shí)，cis-BF對PC12細(xì)胞的毒性效應(yīng)及氧化應(yīng)激存在顯著的對映體選擇性差異，對映體1S-cis-BF的作用明顯強(qiáng)于

3、對映體1R-cis-BF.1S-cis-BF可以更顯著性地抑制PC12細(xì)胞活性，誘導(dǎo)細(xì)胞外乳酸脫氫酶(LDH);同時(shí)1S-cis-BF使PC12細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)水平明顯升高，細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性受到顯著抑制。可見，cis-BF可以對映體特異性地誘導(dǎo)細(xì)胞毒性以及氧化應(yīng)激，并且1S-cis-BF是其引起細(xì)胞毒性和氧化應(yīng)激的主要貢獻(xiàn)者。
　　 (2)在得到了cis-BF可以對映體選擇性地誘導(dǎo)氧化應(yīng)

4、激的結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用熒光定量PCR(qRT-PCR)法進(jìn)一步深入研究了cis-BF對氧化應(yīng)激以及熱休克蛋白相關(guān)基因表達(dá)的影響及對映體選擇性。研究結(jié)果顯示，當(dāng)濃度大于5×10-6molL-1時(shí)，1S-cis-BF可以顯著性地誘導(dǎo)HSP90、HSP70、HSP60、Cu-ZnSOD、MnSOD、CAT以及GST基因表達(dá)上調(diào)，而1R-cis-BF對相關(guān)基因表達(dá)的影響明顯弱于1S-cis-BF。1S-cis-BF對Cu-ZnSOD、MnSOD

5、、GST和CAT基因表達(dá)的誘導(dǎo)可能主要是通過激活p38通路和ERK通路，對HSP90、HSP70和HSP60基因表達(dá)的誘導(dǎo)主要是通過激活p38通路。
　　 (3)以丙溴磷作為手性有機(jī)磷農(nóng)藥的代表，在對映體層面上研究丙溴磷由氧化應(yīng)激介導(dǎo)的PC12細(xì)胞的細(xì)胞毒性的機(jī)制及對映體差異性。MTT、LDH和彗星實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，丙溴磷外消旋體及其對映體對細(xì)胞活性、LDH釋放以及細(xì)胞彗尾長度的影響具有劑量和時(shí)間依賴性，對映體(-)-丙溴磷的毒性

6、明顯高于(+)-丙溴磷和rac-丙溴磷。㈠-丙溴磷可以劑量和時(shí)間依賴性刺激ROS和MDA產(chǎn)生，同時(shí)誘導(dǎo)Cu-ZnSOD、GST、CAT、HSP70以及HSP90基因表達(dá)上調(diào)。而(+)-丙溴磷對相關(guān)基因表達(dá)的影響明顯弱于(-)-丙溴磷及rac-丙溴磷。維生素E(6×104molL-1)預(yù)處理可以劑量依賴性地降低細(xì)胞活性抑制率，使彗尾長度，ROS和MDA水平恢復(fù)至正常水平，進(jìn)一步證實(shí)了氧化應(yīng)激對細(xì)胞毒性的介導(dǎo)。除此之外，我們的研究結(jié)果顯示氧

7、化應(yīng)激的產(chǎn)生先于細(xì)胞毒性和DNA損傷的產(chǎn)生，表明氧化應(yīng)激是丙溴磷產(chǎn)生細(xì)胞毒性和基因毒性的起因而不是結(jié)果。
　　 (4)比較了甲胺磷、乙酰甲胺磷、氯胺磷、馬拉硫磷及馬拉氧磷5種有機(jī)磷農(nóng)藥誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的細(xì)胞毒性、DNA損傷以及氧化應(yīng)激的能力。MTT的結(jié)果顯示，這5種有機(jī)磷在最高濃度80mgL-1時(shí)，對PC12細(xì)胞活性均有顯著抑制，抑制率從大到小排序?yàn)轳R拉氧磷(32.1％)＞甲胺磷(23.3％)＞馬拉硫磷(22.1％)＞氯胺磷(4

8、.0％)＞乙酰甲胺磷(3.2％)。彗星實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，當(dāng)濃度為40mgL-1時(shí)，暴露于有機(jī)磷中的細(xì)胞的彗尾長度和空白對照的比值從高到低依次為:馬拉氧磷(3.02倍)＞甲胺磷(2.35倍)＞馬拉硫磷（1.71倍）＞乙酰甲胺磷(1.44倍)＞氯胺磷（1.07倍）。在對氧化應(yīng)激相關(guān)檢測終點(diǎn)的檢測中發(fā)現(xiàn)，甲胺磷、乙酰甲胺磷、馬拉硫磷和馬拉氧磷可以不同程度地誘導(dǎo)ROS和MDA的增加，并抑制SOD、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽(GSH)活性。維生