促?；鞍讓?duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞中脂滴相關(guān)蛋白表達(dá)的影響及其信號(hào)機(jī)制的研究.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：促酰化蛋白對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞分化進(jìn)程中脂滴相關(guān)蛋白adipophilin、perilipin和TIP47表達(dá)的影響
　　 研究背景：隨著研究深入，脂肪組織為一個(gè)活躍內(nèi)分泌器官的觀(guān)念，已被大多數(shù)學(xué)者所接受。越來(lái)越多的研究表明，脂肪細(xì)胞可以產(chǎn)生多種特異性或非特異性的脂肪因子（adipocytokine），如促酰化蛋白（acylationg stimulating protein，ASP

2、）、脂聯(lián)素（adiponectin）、抵抗素（resistin）、瘦素（leptin）、腔脂素（visfatin）等，這些因子通過(guò)內(nèi)分泌、旁分泌或自分泌的生物學(xué)作用方式，在調(diào)節(jié)糖、脂代謝及維持能量平衡中發(fā)揮重要作用。ASP是一種來(lái)源于補(bǔ)體系統(tǒng)的脂肪因子，目前關(guān)于ASP的研究主要集中在調(diào)節(jié)糖、脂代謝方面。ASP的生物學(xué)作用包括：刺激脂肪細(xì)胞甘油三酯合成（TGS）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)并抑制脂肪分解。ASP具備與胰島素相互疊加而又相對(duì)獨(dú)立的生物學(xué)效應(yīng)

3、。ASP對(duì)餐后甘油三酯（TG）的清除具有重要作用。肥胖及其相關(guān)代謝紊亂性疾病包括2型糖尿病、冠心病、高血壓等，血漿ASP 水平升高，且與體重指數(shù)、血脂密切相關(guān)；而體重下降和運(yùn)動(dòng)鍛煉可使升高的血漿ASP明顯下降。脂滴(Lipid droplets)又稱(chēng)脂肪小體，是脂肪細(xì)胞儲(chǔ)存TG的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。近年來(lái)脂滴相關(guān)蛋白(lipid droplets associated protein)的發(fā)現(xiàn)，使人們認(rèn)識(shí)到脂滴不僅是能量的儲(chǔ)存庫(kù)，還是活躍的脂質(zhì)代

4、謝池，是具有獨(dú)立功能的細(xì)胞器，參與胞內(nèi)運(yùn)輸和脂質(zhì)代謝。Perilipin、adipophilin、TIP47作為PAT家族蛋白的重要成員，不僅僅在脂滴的快速合成、新生脂滴的穩(wěn)定、脂滴的成熟以及脂滴在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)位中發(fā)揮作用，還參與了多種病理過(guò)程的發(fā)生和發(fā)展，脂滴的過(guò)度異位沉積于巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞內(nèi)，將使其轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞,是形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的初始環(huán)節(jié)。
　　 目的：本文旨在通過(guò)觀(guān)察分化過(guò)程中促?；鞍?acyla

5、tion stimulating protein，ASP)對(duì)脂滴相關(guān)蛋白adipophilin、perilipin和TIP47表達(dá)的影響，探討adipophilin、perilipin和TIP47在介導(dǎo)ASP促成脂過(guò)程中的作用。
　　 方法：體外培養(yǎng)小鼠來(lái)源的3T3-L1前脂肪細(xì)胞，經(jīng)典激素雞尾酒法誘導(dǎo)分化，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期工作驗(yàn)證的adipophilin、perilipin和TIP47基因和蛋白水平的時(shí)序性變化規(guī)律選取幾個(gè)代表性

6、的作用時(shí)間點(diǎn)，設(shè)立ASP (1 μmol/L)刺激組、胰島素(100 nmol/L)刺激組及空白對(duì)照組：
　　 (1)[3H]油酸摻入法測(cè)定不同刺激狀態(tài)下脂肪細(xì)胞甘油三酯合成率；
　　 (2)[3H]-2-脫氧葡萄糖([3H]-2-DG)摻入法測(cè)定不同刺激狀態(tài)下脂肪細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)率；
　　 (3)RT-PCR方法檢測(cè)adipophilin、perilipin和TIP47 mRNA表達(dá)；
　　 (4)Wes

7、tern blot方法檢測(cè)adipophilin、perilipin和TIP47蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 (1)脂肪細(xì)胞分化第3天和第6天，ASP組甘油三酯合成率顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05，P<0.01)，胰島素組各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)甘油三酯合成率與正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異；
　　 (2)脂肪細(xì)胞分化第6天和第9天，ASP組和胰島素組葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)率均較同期空白對(duì)照組顯著增加(P<0.05，P<0.01)，其增加效

8、應(yīng)，胰島素組較ASP組更為顯著(P<0.05，P<0.001)；
　　 (3)與空白對(duì)照組相比，ASP組adipophilin基因和蛋白表達(dá)水平從0天起顯著升高(P<0.05，P<0.001)，第4天以后無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，ASP組perilipin基因和蛋白表達(dá)水平從第3天起顯著升高(P<0.05，P<0.001)，直至完全分化成熟(第9天)，仍顯著高于同期正常組(P<0.05)，ASP組TIP47基因和蛋白表達(dá)有顯著的上調(diào)作用

9、，但隨著分化至48h此上調(diào)作用已不明顯；
　　 (4)胰島素組adipophilin和perilipin基因和蛋白表達(dá)水平均與同期對(duì)照組相比無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，胰島素僅在分化的0d對(duì)脂肪細(xì)胞中TIP47 mRNA和蛋白表達(dá)有上調(diào)作用，之后基本無(wú)影響。
　　 結(jié)論：ASP組adipophilin、perilipin和TIP47的表達(dá)與脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中ASP促進(jìn)甘油三酯合成之間具有顯著相關(guān)性，ASP可能通過(guò)調(diào)節(jié)adipoph

10、ilin、perilipin和TIP47基因和蛋白的表達(dá)影響脂肪細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚積和脂滴形成。
　　 第二部分：PLC信號(hào)途徑參與促?；鞍渍{(diào)節(jié)脂滴相關(guān)蛋白的基因/蛋白表達(dá)
　　 背景： 磷脂酶C（Phospholipase C，PLC)為磷脂酰肌醇信號(hào)通路的關(guān)鍵酶，在機(jī)體內(nèi)分布極廣。諸多細(xì)胞外信息分子，如激素、免疫球蛋白、神經(jīng)遞質(zhì)、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等，均可激活磷脂酰肌醇特異性PLC。活化的PLC水解磷脂酰肌醇-4，5-二

11、磷酸（PIP2），產(chǎn)生兩種重要的第二信使：二酯酰甘油(DAG)和三磷酸肌醇（IP3），進(jìn)而將細(xì)胞外的信息傳遞給下游的效應(yīng)分子，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生命活動(dòng)。近期ASP功能性受體C5L2的發(fā)現(xiàn)、純化和鑒定，將ASP在脂代謝領(lǐng)域的研究又大大推進(jìn)，并證實(shí)PLC途徑是ASP/C5L2的重要信號(hào)通路。
　　 目的：本文旨在觀(guān)察阻斷細(xì)胞PLC信號(hào)途徑后，促酰化蛋白(acylation stimulating protein，ASP)對(duì)脂滴相關(guān)蛋白ad

12、ipophilin、perilipin和TIP47表達(dá)影響的變化，探討ASP對(duì)脂滴相關(guān)蛋白adipophilin、perilipin和TIP47的調(diào)控是否有PLC信號(hào)機(jī)制的參與。
　　 方法：體外培養(yǎng)小鼠來(lái)源的3T3-L1前脂肪細(xì)胞，經(jīng)典激素雞尾酒法誘導(dǎo)分化，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期工作驗(yàn)證的adipophilin、perilipin和TIP47基因和蛋白水平的時(shí)序性變化規(guī)律選取幾個(gè)代表性的作用時(shí)間點(diǎn)，設(shè)立ASP (1 μmol/L)刺激

13、組、U73122(5μmol/L)處理組、U73122(5μmol/L)預(yù)處理+ASP (1 μmol/L)刺激組及空白對(duì)照組：
　　 (1)RT-PCR方法檢測(cè)adipophilin、perilipin和TIP47 mRNA表達(dá)變化；
　　 (2)Western blot方法檢測(cè)adipophilin、perilipin和TIP47蛋白表達(dá)變化。
　　 第三部分：PI3K信號(hào)途徑參與促?；鞍渍{(diào)節(jié)脂滴相關(guān)蛋

14、白的基因/蛋白表達(dá)
　　 背景：磷酯酰肌醇3激酶(phosphoinositide-3-kinase,PI3K)家族，為生長(zhǎng)因子超家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的重要分子，能被多種細(xì)胞因子和理化因素激活，是一類(lèi)特異性催化磷酯酰肌醇(phos-phatidylinositol,PI)的3位羥基磷酸化，并產(chǎn)生具有第二信使作用的肌醇脂物質(zhì)的激酶，在細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞生長(zhǎng)凋亡及細(xì)胞代謝等多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Wortmannin是一種霉菌的

15、代謝產(chǎn)物，也是PI3K特異性的抑制劑，最初由Penicillium-wortmannii分離得到，能夠不可逆性地抑制PI3K的活性。有研究報(bào)道，PI3K抑制劑wortmannin和LY294002 (兩者均阻止脂肪分化)預(yù)處理,可阻斷細(xì)胞內(nèi)adipophilin的表達(dá)。Katherine教授實(shí)驗(yàn)室研究證實(shí)，PI3K途徑是介導(dǎo)ASP/C5L2調(diào)控糖、脂代謝的重要信號(hào)通路。
　　 目的：本文旨在觀(guān)察阻斷細(xì)胞PI3K信號(hào)途徑后，促酰化

16、蛋白(acylation stimulating protein，ASP)對(duì)脂滴相關(guān)蛋白adipophilin、perilipin和TIP47表達(dá)影響的變化，利用PI3K特異性抑制劑wortmannin了解PI3K在ASP對(duì)脂滴相關(guān)蛋白adipophilin、perilipin和TIP47調(diào)控中所起的作用。
　　 方法：體外培養(yǎng)小鼠來(lái)源的3T3-L1前脂肪細(xì)胞，經(jīng)典激素雞尾酒法誘導(dǎo)分化，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期工作驗(yàn)證的adipophil

17、in、perilipin和TIP47基因和蛋白水平的時(shí)序性變化規(guī)律選取幾個(gè)代表性的作用時(shí)間點(diǎn)，設(shè)立ASP (1μmol/L)刺激組、wortmannin (100nmol/L)處理組、wortmannin (100nmol/L)預(yù)處理+ASP (1μmol/L)刺激組及空白對(duì)照組：
　　 (1)RT-PCR方法檢測(cè)adipophilin、perilipin和TIP47 mRNA表達(dá)變化；
　　 (2)Western bl