人MDS荷瘤小鼠模型的建立及砷劑、沙利度胺在荷瘤小鼠體內(nèi)抗瘤作用與機(jī)制的研究.pdf

1、骨髓增生異常綜合征(myelodysplasticsyndromes，MDS)是一組起源于造血干/祖細(xì)胞的惡性克隆性疾病，以骨髓病態(tài)造血、外周血細(xì)胞減少及高風(fēng)險轉(zhuǎn)化為急性髓細(xì)胞性白血病(acutemyelocyticleukaemia，AML)為主要特征。迄今MDS的發(fā)病機(jī)制不明，仍無標(biāo)準(zhǔn)有效的治療方案。因此，迫切需要尋找新的有效的治療藥物。三氧化二砷(arsenictrioxide，ATO)，是目前研究的熱點之一。多年來ATO用于治療

2、初發(fā)或復(fù)發(fā)難治性急性早幼粒細(xì)胞白血病(acutepromyelocyticleukemia，APL)療效顯著；ATO治療APL至少通過兩種機(jī)制：一種是降解融合蛋白PMLRARa，去除它對網(wǎng)絡(luò)信號傳導(dǎo)和誘導(dǎo)分化的負(fù)性抑制作用，另一種是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而ATO治療MDS的療效報道不一，其機(jī)制不明。沙利度胺(Thalidomide，THAL)曾經(jīng)是治療妊娠反應(yīng)的老藥，近年來由于它的免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤等作用又重新用于臨床，治療多發(fā)性骨髓瘤和部

3、分實體瘤獲得較滿意的效果。CC5013(為Thalidomide的類似物)治療MDS5q-患者療效明顯，但其機(jī)制不清楚。研究疾病發(fā)病機(jī)理和篩選治療藥物的最好載體之一是動物模型，迄今國內(nèi)外未見有成功建立MDS動物模型的文獻(xiàn)報道。我們試圖通過建立人MDS荷瘤小鼠模型，以探討ATO、THAL單用及聯(lián)用治療在MDS荷瘤小鼠的體內(nèi)抗瘤作用及其機(jī)制，為臨床治療MDS病人提供新的思路和理論依據(jù)。 小鼠體內(nèi)，可通過下調(diào)凋亡蛋白抑制因子cIAP蛋

4、白和Survivin的表達(dá)，去除cIAP對Caspase蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)途徑的抑制作用及Survivin克服G2/M校正點的作用，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生。 BID是Bcl-2家族促凋亡成員，能被Cleavedcaspase-8激活，CleavedBID將凋亡信號由凋亡外通路傳入內(nèi)通路至線粒體，促使線粒體CytC等釋放，從而激活下游Caspase途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。為了探討ATO體內(nèi)是否通過BID、Caspase-8途徑誘導(dǎo)凋亡，我們

5、用Western-blot檢測各治療組BID、Caspase-8的表達(dá)，結(jié)果治療組均未見到BID、Caspase-8的激活帶表達(dá)，提示ATO體內(nèi)誘導(dǎo)凋亡可能是Caspase-8、BID的非依賴途徑。 近年研究發(fā)現(xiàn)，核因子-κB(Nuclearfacter-kappaB)具有十分重要的生物學(xué)功能，與細(xì)胞生長、分化、黏附及細(xì)胞凋亡過程中的基因轉(zhuǎn)錄有關(guān)。而NF-κB的抑制子IκB-α對其功能活化與失活起重要的開關(guān)作用，NF-κB未激活

6、時其異源或同源二聚體與它的阻遏亞基形成IκB-α三聚體存在于胞漿中，IκB激酶(IκBkinase，IKK)能使IκB的絲氨酸32/36磷酸化而被降解，從而激活NF-κB。研究發(fā)現(xiàn)，MDS骨髓中NF-κB活性增高，NF-κB抑制劑在誘導(dǎo)高危MDS細(xì)胞凋亡中起重要作用，NF-κB有望成為高危MDS治療的潛在作用靶點。進(jìn)一步研究表明凋亡抑制蛋白cIAP-1、cIAP-2是NF-κB下游靶基因，NF-κB對IAPs的表達(dá)起正反饋作用，促使后者

7、抑制Caspase活性和細(xì)胞凋亡。 為了探討ATO單用或聯(lián)合THAL體內(nèi)誘導(dǎo)荷瘤細(xì)胞凋亡與NF-κB途徑的關(guān)系，我們首先用EMSA實驗分析了各組NF-κB表達(dá)活性，又用Westernblot檢測IκB-α蛋白(NF-κB抑制子)和凋亡抑制蛋白cIAP的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，治療組NF-κB的活性和cIAP的表達(dá)均顯著下調(diào)，而IκB-α蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。提示ATO體內(nèi)誘導(dǎo)荷瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制涉及NF-κB信號通路。認(rèn)為ATO

8、在MDS荷瘤小鼠體內(nèi)可能通過上調(diào)IκB-α活性，從而抑制NF-κB的活性表達(dá)，使NF-κB喪失其對下游靶點-凋亡抑制蛋白cIAP的正反饋作用，最終去除cIPA對Caspase的抑制作用，促使細(xì)胞凋亡發(fā)生。 AP1(激活蛋白1)是一個轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，它結(jié)合的同源序列為5TGAGTCA-3。Yang等(YangH，JBiolChem，2003)研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α能激活下游靶點AP1和NF-κB，誘導(dǎo)腺苷甲硫氨酸轉(zhuǎn)移酶(MAT2)的表

9、達(dá)上調(diào)，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖；AP1和NF-κB的活性與癌細(xì)胞增殖有關(guān)。我們用EMSA檢測發(fā)現(xiàn)，治療組AP1活性比對照組明顯下調(diào)，提示ATO誘導(dǎo)荷瘤細(xì)胞凋亡與抑制AP1活性有關(guān)。 SP-1作為一種抗凋亡因子和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，能通過抑制NF-kappaB的轉(zhuǎn)錄，去除其抗凋亡活性，促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡。我們的研究顯示，對照組MDS荷瘤小鼠SP1活性增強(qiáng)(EMSA)、伴有荷瘤細(xì)胞凋亡率降低；而ATO治療后，能誘導(dǎo)SP1活性明顯下調(diào)、伴有細(xì)胞凋

10、亡率增高，提示ATO體內(nèi)誘導(dǎo)MDS荷瘤細(xì)胞凋亡的另一機(jī)制可能與下調(diào)SP1的活性、抑制其抗凋亡作用有關(guān)。 小結(jié)：ATO單用及聯(lián)合THAL在MDS荷瘤小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡至少通過了兩條途徑：一是線粒體介導(dǎo)-Caspase依賴的細(xì)胞凋亡途徑；二是核因子kappaB(NF-κB)信號通路，認(rèn)為NF-κB和IκB-α可能成為ATO誘導(dǎo)凋亡、治療MDS的重要藥物靶點之一。這兩條通路相對獨立、又在一定水平上相互聯(lián)系，提示ATO體內(nèi)誘導(dǎo)凋亡機(jī)制