SB-431542對(duì)鈾礦塵所致肺成纖維細(xì)胞合成膠原蛋白的影響.pdf

1、目的：采用TGF-β1抑制劑SB-431542作用于成纖維細(xì)胞，觀察SB-431542對(duì)成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能力、合成羥脯氨酸、Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的影響。探討SB-431542對(duì)成纖維細(xì)胞合成膠原纖維的抑制作用，為尋找防治矽肺纖維化作用靶點(diǎn)提供基礎(chǔ)資料。
　　方法：用120μg/ml的鈾礦塵混懸液作用于RAW264.7巨噬細(xì)胞24h后，分離制備上清液為鈾礦塵組條件培養(yǎng)液；將無(wú)鈾礦塵作用RAW264.7巨噬細(xì)胞培養(yǎng)24h后，分離制備上清

2、液為對(duì)照組用條件培養(yǎng)液。將鈾礦塵組和對(duì)照組條件培養(yǎng)液作用于正常小鼠肺成纖維細(xì)胞（L929細(xì)胞）6、12、18、24、30、36h后。分別測(cè)定細(xì)胞內(nèi)α-SMA的表達(dá)、細(xì)胞外羥脯氨酸、I型膠原(COL I)及III型膠原（COL III)蛋白的含量。通過(guò)不同濃度（0、0.5、1、5、10μmol/L）的SB-431542作用于L929細(xì)胞2h后，再用鈾礦塵組和對(duì)照組條件培養(yǎng)液作用于L929細(xì)胞30h，采用細(xì)胞免疫化學(xué)法和western bl

3、ot測(cè)定細(xì)胞內(nèi)α-SMA的表達(dá)，消化法測(cè)細(xì)胞外羥脯氨酸含量，ELISA法和western blot檢測(cè)細(xì)胞外COL I和COL III蛋白的含量。
　　結(jié)果：
　　1.鈾礦塵對(duì)巨噬細(xì)胞分泌TGF-β1的影響
　　120μg/ml鈾礦塵作用于RAW264.7巨噬細(xì)胞8h后，測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1含量結(jié)果顯示，在染塵初期可見(jiàn)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1含量有所增高，而在染塵16、24、32h后細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TG

4、F-β1含量則明顯高于對(duì)照組中TGF-β1含量，與對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01），且在24h時(shí)達(dá)到峰值144.556±7.125。
　　2.鈾礦塵條件培養(yǎng)上清液對(duì)成纖維細(xì)胞膠原蛋白合成的作用
　　將120μg/ml鈾礦塵刺激巨噬細(xì)胞24h后收集的鈾礦塵條件培養(yǎng)液作用于L929細(xì)胞，經(jīng)6、12、18、24、30、36h作用后，隨著作用時(shí)間的增加，細(xì)胞內(nèi)α-SMA的表達(dá)明顯增多，在作用24-36h后細(xì)胞內(nèi)α-SMA的表

5、達(dá)更為顯著。細(xì)胞外的羥脯氨酸的含量在作用18-36h后與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），作用36h后其羥脯氨酸的含量達(dá)到0.226±0.002 mg/L。鈾礦塵條件培養(yǎng)上清液作用于L929細(xì)胞12至36h后，COL I蛋白的含量逐漸增加，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。而 COL III蛋白的含量的增加主要在作用于18至36h后,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），同時(shí)可見(jiàn)COL I蛋白含量整體水平均

6、高于COL III蛋白含量。
　　3.SB-431542對(duì)成纖維細(xì)胞膠原蛋白合成的作用
　　應(yīng)用不同濃度（0、0.5、1、5、10μmol/L）SB-431542作用于L929細(xì)胞2h后，再用鈾礦塵條件培養(yǎng)液作用L929細(xì)胞30h。SB-431542濃度為5、10μmol/L時(shí)能顯著降低細(xì)胞內(nèi)α-SMA的表達(dá)、顯著降低細(xì)胞外羥脯氨酸和COL I和COL III蛋白含量，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　

7、　結(jié)論：
　　1.120μg/mL鈾礦塵作用于 RAW264.7巨噬細(xì)胞后，能使細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1含量增加，在作用24h后TGF-β1含量達(dá)到峰值。
　　2.120μg/mL鈾礦塵作用于RAW264.7巨噬細(xì)胞24h后收集的鈾礦塵條件培養(yǎng)液能使成纖維細(xì)胞α-SMA表達(dá)增強(qiáng)，成纖維細(xì)胞合成羥脯氨酸、Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白含量增多。
　　3.5μmol/L SB-431542可顯著減少鈾礦塵條件培養(yǎng)液對(duì)成纖維細(xì)胞內(nèi)α-