自人體脂肪組織分離與培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞及磷脂酰膽堿對(duì)體外培養(yǎng)的人脂肪細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、一、自人體脂肪組織分離與培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究 研究背景：種子細(xì)胞是組織工程化組織能夠再生的首要物質(zhì)基礎(chǔ)。干細(xì)胞由于其體外高增殖率和多向分化潛能成為種子細(xì)胞研究的熱點(diǎn)。近年來(lái)，研究顯示脂肪基質(zhì)細(xì)胞中存在著一定量的干細(xì)胞(稱為脂肪組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞，AMSCs)，在一定條件下可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞方向分化。雖然對(duì)AMSCs的初步研究有一定的成果，但是其中仍有許多問(wèn)題有待闡明。如脂肪

2、組織中是否真正存在一類干細(xì)胞，這類干細(xì)胞是否是周圍血中MSCs透過(guò)血液向脂肪組織中的滲透。如何在體外構(gòu)建一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、易推廣的培養(yǎng)方法。分化后的細(xì)胞是否來(lái)源AMSCs，以及AMSCs的免疫性如何等都是有待探討的地方。 目的：探索人脂肪組織源性間充質(zhì)干細(xì)胞(AMSCs)的分離、體外培養(yǎng)方法，以及生物學(xué)特性，為其廣泛應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：無(wú)菌條件下獲取腹部手術(shù)病人皮下脂肪組織，酶消化法分離、培養(yǎng)AMSCs，觀察細(xì)胞形態(tài)

3、并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，計(jì)算細(xì)胞群體倍增時(shí)間。對(duì)第2代細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，鑒定其表面分子CD44表達(dá)。取2～4代細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)為10％胎牛血清，1％青鏈霉素原液，1μmol/L地塞米松，10μmol/L胰島素，0.5mmol/LIBMX的高糖DMEM培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)兩周，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并用油紅“O”染色定性。 結(jié)果：人脂肪組織中含有大量間充質(zhì)干細(xì)胞，接種后細(xì)胞在24小時(shí)內(nèi)貼壁，初為小圓形，2～4天可見(jiàn)細(xì)胞伸展，大多數(shù)細(xì)胞

4、為長(zhǎng)梭形，呈成纖維細(xì)胞樣貼壁生長(zhǎng)，其間也可見(jiàn)形態(tài)、體積不一的多種細(xì)胞成分。此后細(xì)胞增殖旺盛，原代培養(yǎng)的細(xì)胞7～10天即達(dá)70％～80％融合，可進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)，傳代后細(xì)胞形態(tài)無(wú)大變化，體外培養(yǎng)10代以后，細(xì)胞的增殖速度無(wú)明顯減慢。細(xì)胞群體倍增時(shí)間為55小時(shí)左右。免疫化學(xué)染色鑒定70％的培養(yǎng)細(xì)胞呈CD44陽(yáng)性。加入成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)2～4天后，培養(yǎng)皿中就出現(xiàn)含有空泡的脂肪細(xì)胞，1周后達(dá)高峰，同時(shí)細(xì)胞中小脂滴開(kāi)始融合，形成大的脂滴，并開(kāi)

5、始向外界分泌，油紅”O(jiān)”染色后細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量紅染顆粒，證明細(xì)胞內(nèi)顆粒確為脂滴。 結(jié)論：1、本實(shí)驗(yàn)用酶消化法成功的從人體脂肪組織中培養(yǎng)出脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，培養(yǎng)方法比較經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便，容易推廣。2、用免疫組化染色對(duì)培養(yǎng)出的細(xì)胞進(jìn)行表面標(biāo)志CD44分子的鑒定，結(jié)果顯示70％的培養(yǎng)細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)CD44分子，表明在人體脂肪組織中含有可為組織修復(fù)所利用的間充質(zhì)干細(xì)胞，但細(xì)胞成分并不純。3、用含有胰島素、地塞米松及異丁基甲基黃嘌呤的成脂培養(yǎng)基成功

6、誘導(dǎo)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分化成為成熟的脂肪細(xì)胞，誘導(dǎo)作用明顯，方法簡(jiǎn)便。 二、磷脂酰膽堿對(duì)體外培養(yǎng)的人脂肪細(xì)胞作用研究 研究背景：近年來(lái)，可注射性磷脂酰膽堿合劑被用于注射溶脂領(lǐng)域，即在需要減肥的部位皮下注射一種磷脂酰膽堿合劑以達(dá)到溶解脂肪的效果。此種方法由于簡(jiǎn)單、易行，病人不用承受痛苦，不用造成新的創(chuàng)傷等優(yōu)點(diǎn)而有著廣闊的應(yīng)用前景。但對(duì)磷脂酰膽堿是否能溶解脂肪組織、對(duì)于人體是否有副作用以及溶解脂肪后的轉(zhuǎn)歸都有待探討。國(guó)內(nèi)外均缺

7、乏相關(guān)的基礎(chǔ)研究。 目的：探索磷脂酰膽堿對(duì)體外培養(yǎng)的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(AMSCs)向成熟脂肪細(xì)胞分化時(shí)細(xì)胞內(nèi)脂肪積聚，以及對(duì)成熟脂肪細(xì)胞活性的作用。探討其作為皮下注射溶脂藥物的可能性。 方法：體外培養(yǎng)人皮下脂肪組織的脂肪干細(xì)胞，在其成脂培養(yǎng)基中分別加入不同濃度(0、0.05％、0.5％、5％)的磷脂酰膽堿，油紅“O”染色提取法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)脂肪含量，在酶標(biāo)儀上測(cè)定OD值，運(yùn)用SPSS10.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。用不同濃度

8、(0、0.05％、0.5％、5％)的磷脂酰膽堿干預(yù)成熟脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)，分別在干預(yù)3天、5天、7天后用吖啶橙(AO)/溴化乙啶(EB)染色觀察細(xì)胞活性情況。 結(jié)果：磷脂酰膽堿可明顯抑制脂肪干細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化時(shí)胞內(nèi)脂肪積聚，統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示，時(shí)間相同時(shí)各濃度之間OD值與空白對(duì)照組比較均有顯著性意義(P＜0.05)，濃度相同時(shí)，隨著時(shí)間變化，各時(shí)間組OD值之間均有顯著性差異(P＜0.05)；AO/EB染色：空白對(duì)照組的核染色顯示明亮

9、的綠色熒光，顯示細(xì)胞活性良好。和同時(shí)間的空白對(duì)照組比較，0.05％濃度的磷脂酰膽堿對(duì)成熟脂肪細(xì)胞作用3天后表現(xiàn)為誘導(dǎo)凋亡作用，核黃綠色，呈固縮狀。0.5％濃度在作用3天、5天、7天后細(xì)胞均表現(xiàn)為壞死狀態(tài)，核呈橘紅色熒光。5％濃度對(duì)細(xì)胞破壞最為嚴(yán)重，作用5天時(shí)細(xì)胞開(kāi)始完全壞死，出現(xiàn)細(xì)胞溶解，作用7天時(shí)幾乎看不到細(xì)胞結(jié)構(gòu)。 結(jié)論：1、磷脂酰膽堿對(duì)脂肪干細(xì)胞分化過(guò)程中脂肪積聚呈抑制作用。時(shí)間相同時(shí)，濃度越高，這種抑制作用越明顯，濃度相