熱休克蛋白90對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞存活和運(yùn)動(dòng)能力的研究.pdf

1、本文對(duì)熱休克蛋白90對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞存活和運(yùn)動(dòng)能力進(jìn)行了研究。本研究分為兩個(gè)部分：
　　 第一部分：熱休克蛋白90對(duì)缺氧和缺血清誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凋亡保護(hù)作用通過PI3K/Akt和ERK1/2通路。
　　 目的：研究HSP90對(duì)由缺氧/缺血清誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡是否有拮抗作用，同時(shí)研究那些可能機(jī)制參與了HSP90的抗凋亡作用。
　　 方法：通過全骨髓培養(yǎng)的方法獲得大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)過體外

2、培養(yǎng)以后，取3-5代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)實(shí)驗(yàn)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44，CD45，和CD90應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行鑒定。對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞給予缺氧/缺血清培養(yǎng)24小時(shí)后，獲得穩(wěn)定的凋亡模型。為了觀察HSP90對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的作用，給予人重組HSP90α(0，0.01，0.1，1和10μ mol/L)處理骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞24小時(shí)，接著再給予常氧(O221％)或缺氧(O21％)/缺血清培養(yǎng)24小時(shí)。通過四甲基偶氮

3、唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT)對(duì)細(xì)胞的活力進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凋亡檢測(cè)采用Hoechst33258染色和Annexin V/PI方法。通過以上方法得出HSP90最佳的抗細(xì)胞凋亡的濃度。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量-PCR檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞膜表達(dá)的V-erb-b2 rythroblasticleukemia-viral oncogene homolog2(ErbB2)和Toll-like-receptor-4(TLR-4)的mRNA水平。

4、應(yīng)用Western blot法觀察了凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3，Bcl-2，Bax，Bcl-xL的水平。以及HSP90抗細(xì)胞凋亡的下游信號(hào)通路AKT和ERK1/2的磷酸化水平。最后通過比色法檢測(cè)了細(xì)胞上清內(nèi)的一氧化氮(Nitric oxide，NO)的產(chǎn)量，來反映骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在缺氧/缺血清作用下的一氧化氮的分泌量。
　　 結(jié)果：從SD大鼠得到的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過培養(yǎng)以后，對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞鑒定。絕大部份骨髓間

5、充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞表面的CD44和CD90都是陽性的，而CD45陰性。給予人重組HSP90α(0，0.01，0.1，1和10μmol/L)預(yù)處理骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞24小時(shí)，再給予常氧(O221％)或缺氧(O21％)/缺血清培養(yǎng)24小時(shí)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，rhHsp90α在1-10μmol/L濃度范圍都能顯著的對(duì)抗由缺氧/缺血清誘導(dǎo)的干細(xì)胞凋亡。Hsp90減少cleaved caspase-3和Bax的表達(dá)，增加Bcl-2，Bcl-xL的表達(dá)水平。同

6、時(shí)，促進(jìn)NO的分泌，信號(hào)通路AKT和ERK1/2參與hsp90的保護(hù)作用。
　　 第二部分：Hsp90在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞遷移中的作用。
　　 目的：研究MSCs在體外經(jīng)過Hsp90處理后，能否促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞遷移活動(dòng)。并對(duì)這些遷移活動(dòng)的機(jī)制進(jìn)行初步。
　　 方法：經(jīng)過常規(guī)差速貼壁培養(yǎng)得到的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，按實(shí)驗(yàn)分組分為，正常對(duì)照組，轉(zhuǎn)染siRNAHsp90α，17-AAG組，wortmanni

7、n組，U0126組。用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)以及Transwell實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞的遷移能力。用明膠酶譜法檢測(cè)細(xì)胞上清中的MMP-2和MMP-9的活性。用定量-PCR法檢測(cè)CXCR4和VCAM-1的mRNA表達(dá)水平。用Westeen-blot檢測(cè)了MSCs表達(dá)的MMP-2和MMP-9的蛋白水平，以及，phospho-Akt，phospho-ERK1/2的蛋白水平。
　　 結(jié)果：MSCs經(jīng)過24小時(shí)的RhHsp90α(10nM)處理后的細(xì)胞，和

8、未予RhHsp90α(10nM)處理組相比，能顯著提高M(jìn)SCs的遷移能力。應(yīng)用(17-AAG，40 nmol/L，)后，和對(duì)照組相比能明顯抑制MSC的遷移能力。應(yīng)用wortmannin(10μ m)，和U0126(10μ M)后遷移的細(xì)胞明顯比RhHsp90α處理組減少。Real-time PCR檢測(cè)表明，siRNAHsp90α組和正常對(duì)照組相比Hsp90α的表達(dá)下調(diào)88.1±3.5％。同時(shí)細(xì)胞的遷移能力和正常對(duì)照組相比也明顯下降3倍。

9、明膠酶譜法檢測(cè)表明，RhHsp90α處理24小時(shí)后，細(xì)胞上清中的MMP-2和MMP-9的活力比正常對(duì)照組明顯增加，細(xì)胞用17-AAG(40nM)，wortmannin(0.2μ M)以及U0126預(yù)處理后，細(xì)胞的MMP-9活性與RhHsp90α處理組相比明顯被阻斷。MSCs給予rhHsp90α(10nM)處理后，MMP-2和MMP-9的蛋白水平與對(duì)照組相比明顯提高。17-AAG預(yù)處理MSCs后，與rhHsp90α組相比，細(xì)胞的MMP-9

10、和MMP-2水平顯著下降。wortmannin處理后，與rhHsp90α組相比，細(xì)胞的MMP-9水平顯著下降，而MMP-2的水平?jīng)]有明顯變化。U0126處理后，細(xì)胞的MMP-9和MMP-2水平顯著下降與RhHsp90α組相比。MSCs經(jīng)過RhHsp90α處理后，顯著上調(diào)VCAM-1和CXCR4的mRNA水平。17-AAG預(yù)處理MSCs后，VCAM-1和CXCR4的mRNA水平顯著下降。Wortmannin和U0126都能顯著降低MSCs

11、的VCAM-1和CXCR4的mRNA表達(dá)水平。PI3K/Akt和ERK途徑同時(shí)參與RhHsp90α介導(dǎo)的MSCs的遷移作用。
　　 結(jié)論：⑴RhHsp90α體外處理能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移能力。⑵SiRNAHsp90能干擾Hsp90α的促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移能力。⑶MMP-2和MMP-9參與了RhHsp90α體外處理促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移能力這一過程。⑷CXCR4和VCAM-1參與了RhHsp90α體外處理促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干