間充質(zhì)干細胞聯(lián)合熱休克蛋白90α功能性基因序列治療大鼠皮瓣缺血再灌注損傷的實驗研究.pdf

1、研究目的:
　　1.研究熱休克蛋白90α功能性基因序列（以下稱“F-5”基因）的慢病毒載體轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal Stem Cells,MSC）后對間充質(zhì)干細胞生物活性的影響及“F-5”基因在MSC的表達情況；
　　2.探討間充質(zhì)干細胞聯(lián)合轉(zhuǎn)染“F-5”基因移植治療大鼠皮瓣缺血再灌注損傷的臨床效果。
　　研究方法:
　　1.將構(gòu)建好的“F-5”基因慢病毒載體體外轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細胞，確定最佳的病毒感

2、染復(fù)數(shù)，在鏡下觀察細胞形態(tài)、繪制細胞的生長曲線、測定細胞周期、劃痕實驗和MMT檢測轉(zhuǎn)染后的間充質(zhì)干細胞的生物學(xué)活性；熒光顯微鏡和細胞免疫熒光檢測“F-5”多肽在間充質(zhì)干細胞中的表達情況；Elisa分別檢測細胞上清液中F-5多肽在1d、3d、5d、7d和14d的分泌情況。
　　2.設(shè)“F-5”基因慢病毒載體轉(zhuǎn)染后的間充質(zhì)干細胞為實驗組、空載慢病毒載體為對照組、1×PBS為空白組，分別注射移植于缺血再灌注損傷的大鼠腹部皮瓣術(shù)區(qū)；術(shù)后每

3、天觀察皮瓣的顏色、質(zhì)地、毛發(fā)生長、壞死范圍及針刺出血情況等，術(shù)后7d比較各組皮瓣的成活率，并切取成活皮瓣遠端組織分別進行H&E染色、免疫組織化學(xué)染色檢測血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達，并用TUNEL法檢測凋亡細胞,比較各組間的差異。
　　結(jié)果：
　　1.攜帶“F-5”基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細胞后,通過鏡下觀察的細胞形態(tài)、繪制細胞的生長曲線、測定細胞的周期、劃痕實驗和MMT檢測并未見明顯差異；通過細胞免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)

4、在轉(zhuǎn)染后的間充質(zhì)干細胞中的細胞質(zhì)和細胞膜上均能夠檢測到“F-5”多肽的表達；通過Elisa檢測法發(fā)現(xiàn)實驗組從第3天開始細胞上清液中分泌的F-5-flag的量明顯比其他兩組分泌量多，第5天時可發(fā)現(xiàn)實驗組比其他兩組明顯高出10倍的量。
　　2.實驗組皮瓣成活率為（92.38±8.67）%，而對照組為（81.57±7.38）%，空白組為（47.83+6.89）%。實驗組大鼠皮瓣VEGF的表達密度為(91.25±5.92)%，對照組的為(

5、76.37±6.42)%和空白組的為(33.37±6.62)%；各組凋亡細胞陽性表達百分指數(shù)分別為：實驗組（21.4±5.3）%，對照組（23.3±3.6）%，空白組為（54.7±5.7）%。
　　結(jié)論及意義：
　　1.“F-5”基因慢病毒載體轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細胞后對細胞的生物活性無明顯影響，“F-5”基因能夠在MSC中成功表達并將F-5多肽分泌至細胞外，同時本實驗為“F-5”基因在組織修復(fù)等研究工作中提供了實驗基礎(chǔ)；