補(bǔ)陽(yáng)還五湯及其拆方抗腦缺血損傷作用的比較研究.pdf

1、目的:通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn),對(duì)比觀察補(bǔ)陽(yáng)還五湯(Buyanghuanwu Tang,BYHWT)及其拆方,在保護(hù)腦缺血小鼠海馬神經(jīng)元、抗氧化應(yīng)激損傷和調(diào)控凋亡相關(guān)基因Bax、bcl-2蛋白表達(dá)等方面的作用,以尋求該方抗腦缺血損傷的有效組分,探討該方配伍的結(jié)構(gòu)和意義,并為防治腦缺血性疾病中藥新藥的研發(fā)探討一些新的思路。
　　 方法:將120只清潔級(jí)昆明小鼠隨機(jī)分為6組:假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯全方組和補(bǔ)氣活血(Buqihuoxue,B

2、QHX)組、補(bǔ)氣通絡(luò)(Buqitongluo,BQTL)組、活血通絡(luò)(Huoxuetongluo,HXTL)組,每組20只。各中藥組分別以相應(yīng)中藥煎劑,按小鼠體重15ml/Kg灌胃(BYHWT、全方組、BQHX組、BQTL組、HXTL組分別相當(dāng)于21.45、20.10、19.35、3.45g/kg生藥),假手術(shù)組和模型組灌服等量生理鹽水,每日1次,直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。于第3日給藥后2h,所有小鼠經(jīng)10％水合氯醛0.33ml/100g腹腔麻醉,

3、取仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上,頸部正中切口,鈍性分離肌肉組織與血管,充分暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈,術(shù)中注意保護(hù)迷走神經(jīng),模型組和各中藥組均以微動(dòng)脈夾阻斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈血流30 min,然后恢復(fù)灌流,逐層縫合;假手術(shù)組僅暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈30min,不阻斷血流。術(shù)中及術(shù)后注意保暖,待動(dòng)物清醒后放回籠中飼養(yǎng),正常飲食,繼續(xù)灌胃同前。術(shù)后24h各組隨機(jī)選取10只小鼠斷頭處死,迅速剝?nèi)∪X,用手術(shù)刀片沿大腦縱裂將大腦左右半球分離,左側(cè)半球低溫保存,分別采用黃嘌呤

4、氧化酶法、硫代巴比妥酸法檢測(cè)腦組織SOD活性及MDA含量;右側(cè)半球以10％甲醛溶液固定,常規(guī)石蠟切片,免疫組化方法檢測(cè)、并用MoticMed6.0圖像分析系統(tǒng)分析Bax和bcl-2蛋白表達(dá)。其余小鼠于術(shù)后7d全部斷頭處死,迅速剝?nèi)∪X,冠狀切取視交叉后1～4mm腦片,10％甲醛溶液固定,常規(guī)石蠟切片,HE染色,光鏡下觀察海馬CA1區(qū)組織學(xué)分級(jí)并計(jì)數(shù)神經(jīng)元密度(Neuronal density,ND)。
　　 結(jié)果:
　　

5、 1術(shù)后7d海馬CA1區(qū)組織病理學(xué)改變
　　 模型組海馬CA1區(qū)損傷明顯,組織學(xué)分級(jí)多為2級(jí)和3級(jí),明顯高于假手術(shù)組(多為0級(jí)和1級(jí),P＜0.01),提示延遲性神經(jīng)元死亡(Delayedneuron death,DND)嚴(yán)重。各中藥組海馬CA1區(qū)損傷相對(duì)輕微,組織學(xué)分級(jí)多為0級(jí)、1級(jí)和2級(jí),均明顯低于模型組(P＜0.05或P＜0.01),其中補(bǔ)陽(yáng)還五湯全方組、補(bǔ)氣活血組及補(bǔ)氣通絡(luò)組組織學(xué)分級(jí)又明顯低于活血通絡(luò)組(P＜0.05或P

6、＜0.01),而前三者之間無(wú)明顯差異(P＞0.05)。通過(guò)計(jì)數(shù)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密度發(fā)現(xiàn):與假手術(shù)組(211±16n/mm)相比,模型組神經(jīng)元密度(72±22n/mm)明顯降低(P＜0.01);與模型組比較,補(bǔ)陽(yáng)還五湯全方(188±19n/mm)及各拆方組神經(jīng)元密度均明顯升高(P＜0.05或P＜0.01),其中補(bǔ)陽(yáng)還五湯全方組、補(bǔ)氣活血組(175±20n/mm)和補(bǔ)氣通絡(luò)組(178±16n/mm)神經(jīng)元密度又較活血通絡(luò)組(119±17n

7、/mm)明顯升高(P＜0.01),而前三者之間無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　 2術(shù)后24h腦組織SOD活性和MDA含量變化
　　 與假手術(shù)組(SOD:23.39±2.60 U/mgprot,MDA:1.204±0.157nmol/mgprot。單位下同)比較,模型組動(dòng)物腦組織SOD(8.01±1.66)活性明顯降低(P＜0.01),MDA含量(1.966±0.313)明顯升高(P＜0.01);與模型組比較,補(bǔ)陽(yáng)還五湯

8、全方(SOD:22.55±2.37,MDA:1.297±0.199)及各拆方組SOD活性均明顯升高、MDA含量均明顯降低(P＜0.05或P＜0.01),其中補(bǔ)陽(yáng)還五湯全方組、補(bǔ)氣活血組(SOD:21.28±1.92,MDA:1.352±0.146)和補(bǔ)氣通絡(luò)組(SOD:21.37±2.32,MDA:1.321±0.152)又較活血通絡(luò)組(SOD:11.38±2.00,MDA:1.788±0.155)SOD活性明顯升高、MDA含量明顯降低

9、(P＜0.01),而前三者之間無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　 3術(shù)后24h海馬CA1區(qū)Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)
　　 假手術(shù)組海馬CA1區(qū)Bax(0.1438±0.0145。AOD值,下同)及Bcl-2(0.2008±0.0209)蛋白呈微弱表達(dá),與之相比,模型組Bax蛋白表達(dá)(0.3883±0.0310)明顯增強(qiáng)(P＜0.01),Bcl-2蛋白表達(dá)(0.2177±0.0316)亦可見(jiàn)增加,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.

10、05)。與模型組比較,補(bǔ)陽(yáng)還五湯全方(Bax:0.2035±0.0212,Bcl-2:0.3807±0.0328)及各拆方組Bax表達(dá)均明顯減弱(P＜0.05或P＜0.01),Bcl-2表達(dá)均明顯增強(qiáng)(P＜0.01),其中補(bǔ)陽(yáng)還五湯全方組、補(bǔ)氣活血組(Bax:0.2187±0.0250,Bcl-2:0.3616±0.0258)和補(bǔ)氣通絡(luò)組(Bax:0.2188±0.0211,Bcl-2:0.3629±0.0290)又較活血通絡(luò)組(Bax

11、:0.3499±0.0294,Bcl-2:0.2779±0.0331)Bax表達(dá)明顯減弱、Bcl-2表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.01),而前三者之間無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1小鼠腦缺血30min再灌注7d,可致明顯的海馬組織損傷,表現(xiàn)為海馬CA1區(qū)組織學(xué)分級(jí)升高,神經(jīng)元密度降低。補(bǔ)陽(yáng)還五湯及其拆方均能在一定程度上減輕腦缺血引起的海馬組織損傷,以補(bǔ)陽(yáng)還五湯全方作用最明顯,其中補(bǔ)氣活血和補(bǔ)氣通絡(luò)效果優(yōu)于活

12、血通絡(luò),提示補(bǔ)陽(yáng)還五湯中的補(bǔ)氣藥可能是其抗腦缺血損傷作用的最有效組分。
　　 2補(bǔ)陽(yáng)還五湯及其拆方均能在一定程度上提高小鼠缺血腦組織SOD活性,降低MDA含量,以補(bǔ)陽(yáng)還五湯全方作用最明顯,其中補(bǔ)氣活血和補(bǔ)氣通絡(luò)效果優(yōu)于活血通絡(luò),提示補(bǔ)陽(yáng)還五湯能夠明顯增強(qiáng)缺血腦組織抗氧化應(yīng)激損傷的能力,減輕過(guò)氧化產(chǎn)物對(duì)神經(jīng)元的傷害性刺激,從而起到保護(hù)神經(jīng)元的作用,在此過(guò)程中,方中補(bǔ)氣藥可能扮演了最重要的角色。
　　 3補(bǔ)陽(yáng)還五湯及其拆方均