過量氟對大鼠生長板軟骨病理學改變及對Ihh、PTHrP mRNA表達的影響.pdf

1、前言:
　　 氟是人體必需的微量元素之一,對人體健康具有雙重作用,適量的氟是人體必須的,是構成骨骼和牙齒的重要成分,并能夠促進生長發(fā)育和生殖功能。但長期攝入過量的氟可引起以氟斑牙和氟骨癥為主的慢性全身性疾病。
　　 氟骨癥是一種慢性地方性骨關節(jié)病,主要侵害四肢關節(jié)的骨、軟骨和骨周組織,導致關節(jié)功能障礙,嚴重者可致脊柱和四肢關節(jié)畸形。國內外研究報道,飲高氟水的實驗大鼠生長板軟骨細胞增多。生長板是軟骨內成骨的主要發(fā)生部位,正

2、常長骨的縱向生長有賴于生長板軟骨細胞的不斷增殖和分化,所以生長板發(fā)育直接關系到長骨的生長發(fā)育。因此推測,過量氟可通過干擾軟骨內成骨過程造成骨骼生長發(fā)育障礙。流行病學調查結果也證實:高氟飲水延緩兒童骨骼發(fā)育成熟,表現(xiàn)為骨齡延遲且高氟對青春發(fā)育期的兒童影響更為明顯。
　　 軟骨內成骨過程受全身內分泌(包括激素、生長因子)和局部旁分泌及自分泌等多種生長因子的調控,它們對于軟骨的形成和生長發(fā)育的平衡起著重要作用。在局部旁分泌生長因子中,

3、IndianHedgehog(Ihh)信號起關鍵作用,是調控軟骨細胞增殖和分化的核心。Ihh通過三種作用機制調控軟骨內成骨過程:通過Ihh/PTHrP信號負反饋通路調控軟骨細胞的分化;直接調控軟骨細胞的增殖以及調控軟骨膜向成骨細胞分化。
　　 由于生長板剝離比較困難,以往國內有學者就氟對軟骨的影響進行了形態(tài)、生化或組織化學研究,但對于分子生物學機制的研究很少。鑒于Ihh信號通路的作用在氟中毒所致軟骨損傷中的研究仍未見報道,因此我

4、們通過實驗建立氟中毒大鼠模型,觀察生長板軟骨的病理學改變,通過檢測Ihh、PTHrPmRNA的表達水平,探討Ihh信號通路在生長板軟骨細胞增殖、分化中的作用,為闡明氟中毒對生長板軟骨損傷機制提供新的線索。
　　 材料與方法:
　　 一、動物分組
　　 斷乳1周雄性Wistar大鼠32只,體重50～80g,按體重隨機分成4組,分別飲用自來水配制的不同濃度的含氟水。四個劑量組分別為:對照組(飲用自來水含氟離子0.11

5、8mg/L),低氟組(飲水含氟離子50mg/L),中氟組(飲水含氟離子100mg/L),高氟組(飲水含氟離子150mg/L)。
　　 二、實驗方法
　　 1、染氟大鼠一般狀況觀察
　　 整個實驗周期內,觀察染氟大鼠的生長發(fā)育狀況,每周測量并記錄大鼠體重,同時觀察大鼠氟斑牙的發(fā)生情況。
　　 2、大鼠體內氟負荷測定
　　 大鼠體內氟負荷以血清氟和骨氟含量表示。血清氟含量采用酸消化擴散法測定。骨氟含量

6、采用管式爐高溫燃燒水解法-氟離子選擇電極法測定。
　　 3、HE染色及圖像分析
　　 大鼠解剖分離脛骨后,固定3天,脫鈣,石蠟包埋,冰凍切片,制成5μm石蠟切片,用于HE染色。低倍鏡下(10×)觀察,通過ImageJ圖像分析軟件測量生長板厚度、增殖細胞層及肥大細胞層厚度,同時計數(shù)增殖層和肥大層細胞層數(shù),取其平均值。以上測量均采用盲法。
　　 4、軟骨組織總RNA的提取
　　 將生長板軟骨研磨成粉末狀后,采

7、用常規(guī)的RNA提取方法,以RNAisoTMPlus來提取生長板軟骨組織中的RNA。
　　 5、Real-timePCR
　　 取軟骨組織總RNA2μl,測RNA濃度。RT總反應體系10μl。PCR總反應體系25μl,具體步驟如下:cDNA2μl,SYBRPremixExTaqⅡ10μl,上下游引物(10μm)各0.8μl,Rox0.4μl,補水6μl,混勻于0.5ml八聯(lián)管中。
　　 三、統(tǒng)計分析方法
　　

8、 用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,用Kolmogorov-Smimov進行數(shù)據(jù)正態(tài)性分析。組間比較采用單因素方差分析(ANOVA),用LeveneStatistic進行方差齊性檢驗,兩兩比較采用LSD-t檢驗;相關分析用PearsonCorrelation。以p<0.05作為組問差異有統(tǒng)計學意義的判定標準。
　　 實驗結果:
　　 1、染氟大鼠的一般狀況
　　 對照組大鼠皮毛光澤,活動度好;染毒組大鼠皮

9、毛失去光澤,且精神狀態(tài)較差,活動度減少,個別大鼠出現(xiàn)被毛脫落。對照組與實驗組大鼠相比體重沒有顯著性變化(p>0.05)。實驗期間各染氟組大鼠均出現(xiàn)氟斑牙情況,并隨著染氟劑量的升高,氟斑牙的損傷逐漸加重。
　　 2、染氟大鼠血清氟和骨氟測定
　　 染氟3個月后,各染氟組大鼠血清氟和骨氟含量顯著高于對照組(p<0.01),而且隨染氟劑量增高,血清氟和骨氟含量逐漸升高。經(jīng)Pearson相關分析,血清氟、骨氟含量與染氟劑量呈明顯

10、的正相關關系。
　　 3、過量氟對生長板軟骨組織病理學的影響
　　 (1)染氟大鼠生長板軟骨形態(tài)學變化
　　 低倍鏡下(10×)可見,對照組大鼠生長板軟骨邊緣基本整齊,細胞呈柱排列。隨著染氟劑量增加,各染氟組表現(xiàn)為生長板增厚、彎曲,增生層和肥大層軟骨細胞堆積,且排列紊亂,呈舌狀向干骺端伸入,個別大鼠可見生長板過度增厚現(xiàn)象。
　　 (2)大鼠生長板形態(tài)學計量結果
　　 各染氟組生長板厚度均高于對照組

11、,差異具有顯著性(p<0.01)。隨著染氟劑量的增加,各染氟組增殖細胞層與肥大細胞層厚度也隨之增加,增殖細胞層厚度與對照組相比差異具有顯著性(p<0.05或0.01),150mg/L染氟組肥大細胞層厚度與對照組相比增加明顯(p<0.05)。我們通過對增殖細胞層與肥大細胞層厚度的比例計算發(fā)現(xiàn),該比值有增高趨勢,說明增殖細胞與肥大細胞增殖分化過程中原有的平衡被打破。各染氟組增殖細胞層和肥大細胞層數(shù)均出現(xiàn)不同程度的增加,且隨著染氟劑量增高增加

12、更明顯(p<0.01)。經(jīng)Pearson相關分析,生長板厚度、增殖層、肥大層厚度與染氟劑量均呈明顯的正相關關系;增殖層、肥大層細胞層數(shù)與染氟劑量均呈明顯的正相關關系。
　　 4、染氟對Ihh、PTHrPmRNA表達的影響
　　 各染氟組IhhmRNA表達水平高于對照組,150mg/L染毒濃度IhhmRNA表達水平與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。PTHrPmRNA的表達水平高于對照組,呈升高趨勢,但沒有顯著性