TOP2A在胃癌中的表達(dá)及TOP2A低表達(dá)胃腺癌細(xì)胞模型的建立.pdf

1、[目的]由于拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα(Topoisomerase IIα)基因TOP2A在染色體分離、配對(duì)、濃縮、結(jié)構(gòu)形成及改變DNA超螺旋結(jié)構(gòu)有重要的作用，并且又是很多腫瘤化療藥物的作用靶點(diǎn)，因此它在腫瘤治療中引起了特殊的關(guān)注。我科基因芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃腺癌組織中的TOP2A明顯高表達(dá)，本課題擬通過(guò)病例調(diào)查，明確TOP2A在人胃癌組織中的表達(dá)特征，并進(jìn)一步建立TOP2A基因低表達(dá)的胃腺癌細(xì)胞模型，明確抑制TOP2A蛋白表達(dá)對(duì)其生物學(xué)行為的影響，為

2、將來(lái)探討TOP2A蛋白表達(dá)對(duì)topoII抑制劑的療效的預(yù)測(cè)作用提供良好的基礎(chǔ)。
　　 [方法]本研究共分兩部分：
　　 第一部分，首先從2004年-2008年從本院就診的胃癌患者中篩選出做TOP2A蛋白免疫組化染色患者200例，根據(jù)其TOP2A蛋白表達(dá)量的高低及分化程度、病變部位分組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；其次，用WesternBloting(WB)法檢驗(yàn)胃癌細(xì)胞株MGC-803、BGC-823及乳腺癌細(xì)胞株MCF-7中TOP2A

3、蛋白的表達(dá)。
　　 第二部分，設(shè)計(jì)構(gòu)建針對(duì)TOP2A基因的shRNA(smallhairpin RNA，短發(fā)夾RNA)重組表達(dá)質(zhì)粒pSRZTop IIα并轉(zhuǎn)染至G3T-hi包裝細(xì)胞，收集綠色熒光蛋白表達(dá)陽(yáng)性的包裝細(xì)胞病毒上清，測(cè)定病毒滴度，感染三株目的細(xì)胞BGC-823、MGC-803及MCF-7，流式分選陽(yáng)性克隆，擴(kuò)增并培養(yǎng)。WB檢測(cè)三株目的細(xì)胞感染重組逆轉(zhuǎn)錄病毒pSRZTop IIα后細(xì)胞內(nèi)TOP2A的表達(dá)情況，并用細(xì)胞生長(zhǎng)

4、曲線的方法記錄感染病毒前后細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)及活性的變化。
　　 [結(jié)果]
　　 第一部分，200例TOP2A蛋白表達(dá)陽(yáng)性患者其表達(dá)量的高低與患者年齡、性別、胃癌分化程度及胃癌部位并無(wú)相關(guān)性；胃腺癌細(xì)胞BGC-823、MGC-803和乳腺癌細(xì)胞MCF-7的總蛋白進(jìn)行Western bloting檢測(cè)，均有TOP2A的表達(dá)。
　　 第二部分，酶切及測(cè)序鑒定pSRZTop IIα質(zhì)粒構(gòu)建成功，pSRZTop IIα表達(dá)質(zhì)粒

5、轉(zhuǎn)染至G3T-hi包裝細(xì)胞后收集病毒上清，病毒滴度測(cè)定結(jié)果最高達(dá)1.87×107，由此證實(shí)逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建成功；目的細(xì)胞感染病毒并分選后進(jìn)行熒光顯微鏡觀察，64h的熒光蛋白表達(dá)比率較17h明顯增高，證實(shí)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染目的細(xì)胞成功，三株目的細(xì)胞感染后TOP2A蛋白表達(dá)較陰性對(duì)照組明顯降低，胃腺癌細(xì)胞MGC-803細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì)較未感染組和陰性對(duì)照組明顯減慢，各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞計(jì)數(shù)值明顯降低。
　　 [結(jié)論]1.靶向TOP2A的shRNA能瞬