食管癌靶向免疫治療及機制探討.pdf

1、食管癌是我國高發(fā)的惡性腫瘤之一，95％以上為鱗狀上皮細(xì)胞癌(ESCC)。ESCC早期無明顯癥狀，大多數(shù)患者就診時已失去最佳治療機會。盡管幾十年來，手術(shù)和放化療取得較明顯進(jìn)展，但ESCC惡性程度高，易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，對放化療不敏感性，其總體五年生存率仍徘徊在15％左右。因此，研究新型輔助治療手段對改善ESCC患者預(yù)后有重要意義，免疫治療為提高ESCC患者總體生存率帶來新的希望。ESCC癌變機理至今未完全清楚，大量研究表明，ESCC與高危型HPV

2、s感染關(guān)系密切，HPVs E6/E7癌基因持續(xù)表達(dá)是感染上皮惡性轉(zhuǎn)化和維持惡性表型的關(guān)鍵，E6/E7癌蛋白是公認(rèn)的理想靶抗原。本研究以Hu-PBL-SCID小鼠為模型，觀察HPV16E6/E7融合蛋白疫苗抑制HPV16 E7陽性ESCC的生長并探討其機制，為食管癌疫苗研究提供新的思路。 本文采用有限稀釋法從食管癌細(xì)胞系EC9706中建立了兩個亞克隆，EC9706S1和EC9706S2。 Western Blot(以CaSki為陽

3、性對照)顯示EC9706S1表達(dá)高水平E7，而EC9706S2 E7陰性。流式細(xì)胞術(shù)分析、生長曲線和平板克隆形成等實驗證實：所建立的ESCC亞克隆保持親本細(xì)胞的生物學(xué)行為。因此，EC9706S1和EC9706S2分別作為本研究的實驗靶細(xì)胞和陰性對照。 為了模擬人免疫系統(tǒng)對融合蛋白疫苗產(chǎn)生免疫應(yīng)答及其對EC9706S1細(xì)胞生長的影響，先經(jīng)腹腔輸入人PBLs建立了Hu-PBL-SCID嵌合小鼠模型。ELISA證實：免疫重建兩周后，9

4、0％小鼠血漿中人IgG達(dá)10μg/ml以上。流式細(xì)胞術(shù)顯示小鼠脾臟中存在人CD4<'+>和CD8<'+>淋巴細(xì)胞，小鼠均未出現(xiàn)GVHD。 為進(jìn)一步明確CTLs殺傷腫瘤細(xì)胞的分子機制，用Western Blot分析各組移植瘤中穿孔素/顆粒酶途徑、凋亡受體和線粒體途徑相關(guān)分子變化情況。結(jié)果顯示：疫苗組腫瘤中PFN、GrB和TNF-α表達(dá)水平顯著提高，Caspase-3明顯激活及PARP剪切；同時Caspase-8也明顯活化(出現(xiàn)p1

5、8)，提示凋亡受體途徑參與GrB介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。Caspase-9出現(xiàn)兩種激活片段，p35和p37，說明其既存在自我加工又可能同時受到Caspase-3剪切。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，疫苗組腫瘤中Bcl-2表達(dá)水平無明顯變化，但Bid明顯剪切(p15)；同時胞漿中Smac、Cyt-c含量相對高，而cIAP-1水平降低。更重要的是，體外Caspase-8和Caspase-9活性抑制實驗證實Caspase-8抑制劑幾乎完全抑制CTL殺傷活性，而Ca

6、spase-9抑制后對CTL活性無明顯影響。實驗還發(fā)現(xiàn)：實驗?zāi)[瘤組織中VEGF表達(dá)下調(diào)，但各組移植瘤的TGF-β表達(dá)水平無明顯差異。 結(jié)論：1.本研究建立了遺傳背景一致，HPVE7高表達(dá)和不表達(dá)的ESCC細(xì)胞株。2.建立了Hu-PBL-SCID嵌合小鼠模型。3.首次證明HPV16 E6/E7融合蛋白疫苗在Hu-PBL-SCID小鼠體內(nèi)能誘導(dǎo)特異性CTL反應(yīng)并有效殺傷腫瘤細(xì)胞，對HPV16 E7陽性ESCC和CaSki細(xì)胞生長有明