放射性腦損傷大鼠動物模型的建立及其海馬神經(jīng)元P35及P25的表達(dá)變化.pdf

1、放射性腦損傷是頭頸部腫瘤放射治療后經(jīng)常發(fā)生的一種嚴(yán)重并發(fā)癥。除醫(yī)源性放射性腦損傷外，放射事故性損傷如意外核泄露、戰(zhàn)爭中的核武器損傷也可能造成放射性腦損傷。腦、脊髓接受過量照射后可導(dǎo)致局部出現(xiàn)水腫，梗塞或壞死，嚴(yán)重影響病人的生存質(zhì)量。臨床觀察結(jié)果表明，認(rèn)知功能損害的嚴(yán)重程度與內(nèi)側(cè)顳葉受照射劑量有關(guān)，可能與海馬功能受損有關(guān)，因?yàn)楹ｑR區(qū)神經(jīng)元對放射線非常敏感。放射性腦損傷已成為治療頭頸部腫瘤的劑量限制性因素，治療效果差。預(yù)防或減輕放射性腦損傷

2、是放療學(xué)家和神經(jīng)學(xué)家關(guān)注的課題，對提高患者的生存質(zhì)量具有重要的臨床價值和社會意義。 迄今為止，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為放射性腦損傷是多因素共同作用的結(jié)果。放射線通過直接物理損傷和產(chǎn)生自由基導(dǎo)致的間接損傷作用，損傷神經(jīng)細(xì)胞，引起腦組織退行性病變。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，海馬區(qū)和室管膜下區(qū)是對輻射最敏感的區(qū)域，此區(qū)域內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞破壞將影響放射性腦損傷的程度及恢復(fù)。另一種學(xué)說是血管損傷學(xué)說，此學(xué)說認(rèn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞死亡增加導(dǎo)致血管損傷、缺血，而血管損傷是晚

3、期放射性腦損傷的主要病理基礎(chǔ)之一。放射性腦損傷也可能是由于自身免疫反應(yīng)所致：少突膠質(zhì)細(xì)胞及其酶系統(tǒng)在照射后產(chǎn)生自身抗原，誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)，導(dǎo)致脫髓鞘、腦水腫等改變，加重神經(jīng)細(xì)胞的損傷。 放射能引起細(xì)胞凋亡，是在若干基因指導(dǎo)下一系列生化級聯(lián)反應(yīng)的結(jié)果，主要的生化變化有：DNA損傷、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)發(fā)生變化、激酶活化、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變等。DNA是放射線作用于細(xì)胞最重要的靶，DNA單鏈或雙鏈斷裂，引起激酶的活性改變，激活一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通

4、路，破壞細(xì)胞膜及骨架結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞退行性變和功能失調(diào)。最近很多研究集中于Cdk5（cyclin-dependent kinase5細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶5）在多種毒性物質(zhì)誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡中的調(diào)節(jié)作用，并發(fā)現(xiàn)Cdk5在神經(jīng)退行性病變的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，這一發(fā)現(xiàn)引起了神經(jīng)學(xué)界的廣泛關(guān)注，但對于Cdk5在神經(jīng)元放射性損傷中的作用，尚未有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。 Cdk5屬于絲氨酸/蘇氨酸周期素依賴性蛋白激酶，是細(xì)胞周期素依賴蛋白激酶（C

5、yclin-dependent kinase5 Cdks）家族中特殊的一員，不參與細(xì)胞周期的調(diào)控。生理狀態(tài)下，Cdk5在P35、P39等調(diào)節(jié)亞基的信號作用下錨定于膜上，磷酸化膜性底物，通過平衡促凋亡和促存活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在神經(jīng)元發(fā)育、遷移、神經(jīng)元存活中發(fā)揮重要作用。Cdk5表達(dá)于全身各個組織，然而非周期素蛋白P35、P39特異地存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中，因此，Cdk5激酶激活主要限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)是因其激活劑分布局限性所致。也有研究

6、發(fā)現(xiàn)周圍神經(jīng)系統(tǒng)的三叉神經(jīng)節(jié)的感覺神經(jīng)元的萎縮與Cdk5有關(guān)，認(rèn)為Cdk5在周圍神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中也起著重要作用。缺乏Cdk5及其調(diào)節(jié)亞基的胎鼠大腦可損害神經(jīng)元，包括海馬區(qū)、大腦皮層、小腦、嗅球、丘腦及腦干。Cdk5基因敲除技術(shù)可使大腦皮層缺失，而導(dǎo)致胎鼠死亡。Cdk5在哺乳動物海馬神經(jīng)元的學(xué)習(xí)和記憶功能中也發(fā)揮著重要作用。如果Cdk5在病理狀態(tài)下被過度激活并異常分布，可能導(dǎo)致神經(jīng)元變性壞死。Cdk5在多種人類神經(jīng)退行性疾病中起非常重要的

7、作用，可能是構(gòu)成包括阿爾茨默氏病（AD）、肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）、帕金森病（PD）、進(jìn)行性核上性麻痹（PSP）、Pick病等神經(jīng)變性疾病的主要分子病理基礎(chǔ)。 DNA損傷是神經(jīng)退行性病變的觸發(fā)因子。一般情況下，外界毒性因素作用于神經(jīng)元，引起DNA損傷，通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起鈣離子過度釋放，引起鈣離子激活的蛋白水解酶Calpain激活，水解P35為P25和P10，P25與Cdk5結(jié)合，通過一系列底物的磷酸化，破壞神經(jīng)元的膜和

8、骨架結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡。有文獻(xiàn)報(bào)道，在原代皮層神經(jīng)元中，神經(jīng)興奮性毒素、缺氧負(fù)荷、鈣內(nèi)流都可導(dǎo)致P25蛋白表達(dá)的增加。 如果證實(shí)Cdk5及其調(diào)節(jié)亞基P35/P25、P39在放射性腦損傷中發(fā)揮促凋亡作用，那么我們就可以通過對它們進(jìn)行調(diào)節(jié)，而達(dá)到對腦放射性損傷的防護(hù)和治療價值，提高治療神經(jīng)腫瘤的放療效果。本實(shí)驗(yàn)通過建立放射性腦損傷大鼠模型，探討Cdk5的調(diào)節(jié)亞基P35、P25在放射性腦損傷中所起的作用及其機(jī)制。 目的:

9、 1）建立大鼠放射性腦損傷模型并觀察照射后海馬區(qū)神經(jīng)元的改變，確定放射性腦損傷與劑量的關(guān)系，為臨床放射治療劑量的確定提供理論依據(jù)； 2）觀察單次全腦照射后大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元P35及P25蛋白表達(dá)的變化，探討放射性腦損傷的機(jī)制，為尋找放射性腦損傷的防治方法提供新的思路。 [方法] 1）將72只雄性SD大鼠隨機(jī)分為單次全腦照射0Gy、10Gy、20Gy、30Gy4個組，構(gòu)建大鼠的放射性損傷模型； 2）應(yīng)用尼

10、氏染色觀察照射后不同時間點(diǎn)（照射后3h、6h、12h）各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的數(shù)目，觀察各劑量組與時間點(diǎn)神經(jīng)元數(shù)量的變化； 3）成功建立大鼠放射性損傷模型后，將12只SD雄性大鼠隨機(jī)分為0Gy、10Gy、20Gy、30Gy4個組，每組3只大鼠。蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)檢測各劑量組海馬區(qū)P35、P25蛋白的表達(dá)變化； 4）另取9只SD大鼠，蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)檢測大鼠經(jīng)全腦30Gy劑量照射后各個時間點(diǎn)（照射后3h、6h、12h，每組3

11、只大鼠）P35、P25蛋白的表達(dá)變化。 結(jié)果: 1）照射后可觀察到海馬區(qū)神經(jīng)元死亡，成功建立大鼠放射性腦損傷模型； 2）與對照組相比，10Gy組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)目無顯著變化（P>0.05）。20、30Gy組神經(jīng)元數(shù)目有顯著變化（P<0.05）；與照射后3h、12h比較，照射后6h神經(jīng)元數(shù)目有顯著性變化（P<0.05）； 3）Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對照組相比，10Gy組P35蛋白表達(dá)無

12、顯著變化（P>0.05）；20Gy、30Gy照射組P35表達(dá)減少（P<0.05）。10Gy組P25蛋白表達(dá)無顯著變化（P>0.05）；20Gy、30Gy照射組P25蛋白表達(dá)增強(qiáng)（P<0.05）； 4）大鼠全腦照射后各時間點(diǎn)P35及P25蛋白表達(dá)的變化：大鼠全腦照射30Gy后3h、12h大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞中P35、P25蛋白表達(dá)無顯著差別（P>0.05）。照射后6h，P35蛋白表達(dá)減弱（P<0.05），P25蛋白表達(dá)增強(qiáng)（P<0.0