顛茄pmt、trI、h6h雙基因策略對(duì)顛茄毛狀根托品烷類生物堿含量的影響.pdf

1、顛茄是我國(guó)藥典規(guī)定托品烷類生物堿來源的唯一藥用植物,也是莨菪堿、東莨菪堿最主要的商業(yè)藥源(國(guó)家藥典委員會(huì)2011版)。與莨菪堿相比,東莨菪堿副作用小、藥理作用強(qiáng),所以需求量十分巨大。野生顛茄中東莨菪含量非常低,而在商用栽培顛茄中,東莨菪堿含量也僅為干重的0.01-0.08%。近年來,隨著托品烷類生物堿生物合成途徑分子生物學(xué)研究的深入,使得在分子水平實(shí)現(xiàn)包括莨菪堿和東莨菪堿在內(nèi)的TAs生物合成的代謝調(diào)控取得了重要進(jìn)展。特別是目前東莨菪堿代

2、謝途徑上的一些功能基因的確定,為利用托品烷類代謝工程技術(shù)提高顛茄中東莨菪堿含量打下了基礎(chǔ)。
　　 在托品烷類生物堿代謝途徑中,pmt、trI和h6h是重要的基因。其中,pmt為上游重要基因,trI為中間分支點(diǎn)基因,h6h為下游重要基因。研究表明,在顛茄毛狀根和顛茄植株中,外源pmt、trI、h6h的高度表達(dá)對(duì)莨菪堿和東莨菪堿含量的變化都是有所相關(guān)的:將煙草pmt基因轉(zhuǎn)入白曼陀羅,莨菪堿的含量提高2倍多,東莨菪堿的含量提高3倍多;

3、在顛茄中高度表達(dá)曼陀羅trI,莨菪堿的含量提高了3倍多,東莨菪堿的含量提高了5倍多;將莨菪的h6h導(dǎo)入到埃及莨菪中,最好的克隆產(chǎn)生了17mg/L的東莨菪堿,是對(duì)照克隆的100倍以上。而內(nèi)源基因在其中的作用尚不清楚。針對(duì)這點(diǎn),在之前研究基礎(chǔ)上,本文通過內(nèi)源pmt、trI、h6h的雙基因策略研究對(duì)顛茄毛狀根莨菪堿和東莨菪堿含量的影響。
　　 分別構(gòu)建攜帶目的基因的植物高效雙元表達(dá)載體p1304+-pmt-trI、p1304+-pmt

4、-h6h和p1304+-trI-h6h,轉(zhuǎn)化“卸甲”的根癌農(nóng)桿菌C58C1獲得工程菌C58C1-p1304+-pmt-trI、C58C1-p1304+-pmt-h6h和C58C1-p1304+-trI-h6h,遺傳轉(zhuǎn)化顛茄葉片。在C58C1-p1304+-pmt-trI組合中,經(jīng)檢測(cè)rolC、hygr和pmt、trI基因后成功篩選出6個(gè)轉(zhuǎn)基因發(fā)根系,分別進(jìn)行液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)然后檢測(cè)托品烷類生物堿(Tas)含量和基因表達(dá)量。其中有4個(gè)發(fā)

5、根系的總Tas含量得到了提高,依次為PT11＞PT17＞PT13＞T3,PT11的總Tas含量約為空菌發(fā)根對(duì)照(NC)的2.5倍;有2個(gè)發(fā)根系的含量維持不變或明顯降低,但東莨菪堿的含量有所提高。莨菪堿和東莨菪堿含量提高最多的PT11相比空白對(duì)照分別提高了2倍和5.7倍。基因表達(dá)量上,除了FT2的pmt基因表達(dá)量較空白發(fā)根低,其他轉(zhuǎn)基因發(fā)根系的pmt和h6h基因的表達(dá)量都比空白對(duì)照高。在C58C1-p1304+-pmt-h6h組合中,經(jīng)檢

6、測(cè)rolC、hygr和pmt、h6h基因后成功篩選出5個(gè)轉(zhuǎn)基因發(fā)根系,分別進(jìn)行液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)然后檢測(cè)Tas含量和基因表達(dá)量。其中有2個(gè)發(fā)根系的總Tas含量得到了提高,為PH2＞PH14,PH2的總Tas含量約為空菌發(fā)根對(duì)照(NC)的2.7倍;有3個(gè)發(fā)根系的含量維持不變或明顯降低,但東莨菪堿的含量有所提高。在這5個(gè)發(fā)根系中,莨菪堿和東莨菪堿含量提高最多的PH2比空白對(duì)照分別提高了1.8倍和8.2倍。除了PH32的pmt基因表達(dá)量低于空

7、白對(duì)照,其余轉(zhuǎn)基因發(fā)根系的pmt和h6h基因表達(dá)量都有所提高或持平。在C58C1-p1304+-trI-h6h組合中,經(jīng)檢測(cè)rolC、hygr和trI、h6h基因后成功篩選出4個(gè)轉(zhuǎn)基因發(fā)根系,分別進(jìn)行液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)然后檢測(cè)TAs含量和基因表達(dá)量。其中有3個(gè)發(fā)根系的總TAs含量得到了提高,為HT2＞HTA1＞HTA3＞HT16,HT2的總Tas含量約為空菌發(fā)根的2.6倍;有1個(gè)發(fā)根系的含量降低,但東莨菪堿的含量有所提高。莨菪堿和東莨菪

8、堿含量提高最多的HT2比NC分別提高了2.1倍和5.6倍。HT2的h6h表達(dá)量為最高,其東莨菪堿含量也為最高,HTA1、HTA3、HT16的h6h基因表達(dá)量與NC接近,但trI基因的表達(dá)量有很大的提高。上述基因的具體表達(dá)量與含量水平之間并不完全一致,這可能是由于雙轉(zhuǎn)的基因在表達(dá)上產(chǎn)生了共抑制,使轉(zhuǎn)基因發(fā)根在基因的高表達(dá)下反而含量保持不變或有所降低。但總體上,雙基因策略在托品烷類生物堿合成途徑中可能存在協(xié)同作用。轉(zhuǎn)基因發(fā)根個(gè)體間托品烷類生

9、物堿合成能力有個(gè)體差異,但是并沒有改變兩個(gè)基因過量表達(dá)能夠提高東莨菪堿含量的趨勢(shì),說明雙基因的遺傳轉(zhuǎn)化能夠打破顛茄托品烷類生物堿合成途徑中的限速反應(yīng)步驟,從而推動(dòng)代謝流更多的向托品烷類生物堿合成方向流動(dòng),提高了莨菪堿和東莨菪堿合成能力,最終表現(xiàn)為兩者含量的提高。
　　 pmt是東莨菪堿生物合成途徑中的第一個(gè)重要酶基因,其過量表達(dá)能夠?yàn)橄掠蔚臇|莨菪堿合成提供更為充足的前體物質(zhì);trI是東莨菪堿生物合成途徑中的一個(gè)分支點(diǎn),使代謝流更