TRAIL聯(lián)合XIAP反義寡核苷酸誘導膠質(zhì)母細胞瘤凋亡的實驗研究.pdf

1、TRAIL又稱凋亡素-2配體(APO-2ligand，APO-2L)，是新近發(fā)現(xiàn)的凋亡誘導配體，屬腫瘤壞死因子(TNF)家族，通過與其跨膜的死亡受體(DR)相結合，激活caspase酶(半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶)依賴的細胞凋亡途徑，caspase-3是該凋亡通路上最主要的終末剪切酶[3]。研究表明，TRAIL可以引起多種腫瘤細胞發(fā)生凋亡，而對正常細胞卻沒有毒性作用[1、12]，提示TRAIL有可能成為新一代廣譜抗腫瘤藥物。目前的研究

2、證明，TRAIL對大多數(shù)來自肝、胃、血液及皮膚的惡性腫瘤細胞有抑制細胞生長的作用，但同時也發(fā)現(xiàn)有很多的腫瘤細胞對TRAIL誘導的凋亡耐受[35]引，限制了其在臨床上的廣泛應用，提高這些腫瘤細胞對TRAIL的敏感性成為目前亟待解決的問題。目前有關TRAIL誘導腫瘤細胞凋亡的研究多集中在消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)腫瘤及黑色素瘤方面，有關膠質(zhì)母細胞瘤的相關研究，國內(nèi)外尚未見報道。 XIAP是一種新發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制因子，屬凋亡抑制蛋白(IAPs)

3、家族，通過抑制caspase酶活性而對細胞凋亡過程起重要調(diào)控作用。BIR結構域(桿狀病毒1AP重復序列區(qū)，BIR)和RING鋅指結構域是IAPs家族抑制caspase活性，發(fā)揮凋亡抑制作用不可缺少的結構。XIAP分子N一端的3個BIR結構域可以結合并抑制caspase-3、caspase-7和caspase-9，XIAP的C一端有1個RING鋅指結構域，具有泛素連接酶E3活性，可以促進與XAIP相互作用的蛋白質(zhì)泛素化降解。因此，XIAP

4、既通過BIR結構域抑制caspase活性，也通過RING結構域催化caspase泛素化降解，從而阻止多種因素誘導的細胞凋亡。通過下調(diào)細胞中XIAP的表達，解除XIAP對caspase酶的抑制，有可能成為提高caspase酶依賴的TRAIL誘凋亡通路效率的有效途徑。國外已有學者通過利用XIAP反義寡核苷酸(XIAP-ASODN)封閉XlAP的表達，在肝癌細胞中觀察到了caspase酶表達的增加。 膠質(zhì)母細胞瘤是常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，

5、在神經(jīng)上皮性腫瘤中占22.3％，具有惡性程度高、生長迅速、病程短等特點[54]。目前對該瘤的治療方案多以手術為主，或術后輔以放療、化療或免疫治療。由于腫瘤惡性程度高，常常侵犯幾個腦葉，術后又極易復發(fā)，因此，上述綜合治療方法效果并不十分理想。有資料顯示，膠質(zhì)母細胞瘤目前的平均生存時間僅為1年，這對人們的身體健康構成極大威脅。因此，膠質(zhì)母細胞瘤的治療在醫(yī)學領域成為一個世界性難題和研究熱點。以往的研究表明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展不僅與腫瘤細胞的克隆性

6、異常增生有關，而且與腫瘤細胞正常凋亡功能的減弱有密切關系。因此，膠質(zhì)母細胞瘤的治療研究中，腫瘤細胞的凋亡誘導治療逐漸引起人們的重視。 上述研究表明，在caspase酶依賴的凋亡通路中，TRAIL和XIAP是起正性作用和負性作用的兩個方面。有關TRAIL及XIAP-ASODN的獨立研究在部分腫瘤中已有開展，但是，TRAIL聯(lián)合XIAP-ASODN誘導腫瘤細胞凋亡的研究，國內(nèi)外尚屬空白。為探討TRAIL對膠質(zhì)母細胞瘤凋亡的誘導作用，

7、以及XIAP-ASODN對TRAIL誘導膠質(zhì)母細胞凋亡的增效作用，本研究采用陽離子脂質(zhì)體介導的反義寡核苷酸體內(nèi)外治療法，以及免疫組織化學和分子生物學技術進行了膠質(zhì)母細胞瘤體內(nèi)外治療的相關研究。本研究分為三個部分。 第一部分，TRAIL受體及XIAP在膠質(zhì)母細胞瘤中表達的實驗研究。 第二部分，TRAIL聯(lián)合XIAP-ASODN體外誘導膠質(zhì)母細胞瘤的實驗研究。 第三部分，TRAIL聯(lián)合XIAP-ASODN在裸鼠體內(nèi)誘

8、導膠質(zhì)母細胞瘤凋亡的實驗研究。 結論： 本研究首次應用免疫組化、RT-PCR、Westernblot、TUNEL、FCM等技術，聯(lián)合檢測了TRAIL-R和XIAP在膠質(zhì)母細胞瘤及其A-172細胞株中的表達，并在體內(nèi)外系統(tǒng)地觀察了TRAIL、XIAP-ASODN及TRAIL聯(lián)合XIAP-ASODN對膠質(zhì)母細胞瘤的凋亡誘導治療作用，得出如下結論： 1．在膠質(zhì)母細胞瘤TRAIL/TRAIL-R凋亡通路中，起重要調(diào)控作用

9、的TRAIL-R是DR4、DR5和DcRl。在膠質(zhì)母細胞瘤中，存在著DR高表達和DcRl低表達的差異性表達，差異性表達的調(diào)控位于轉錄后水平，這種差異性表達為利用TRAIL進行膠質(zhì)母細胞瘤的凋亡誘導治療奠定了理論基礎。 2．XIAP在膠質(zhì)母細胞瘤中普遍高表達，這可能是膠質(zhì)母細胞瘤逃逸凋亡的內(nèi)在原因之一，同時也是膠質(zhì)母細胞瘤對TRAIL誘導的凋亡敏感性不強的重要原因；XIAP-ASODN能夠有效地下調(diào)膠質(zhì)母細胞瘤中XIAP的表達，同

10、時，提高TRAIL誘凋亡通路中關鍵酶caspase-3的表達。 3.膠質(zhì)母細胞瘤臨床放射治療的內(nèi)在機制之一，是通過上調(diào)DR及下調(diào)XIAP的表達，增強了腫瘤細胞對TRAIL的敏感性。 4.經(jīng)過觀察不同濃度的TRAIL及XIAP-ASODN對A一172細胞的作用過程，發(fā)現(xiàn)200ng/m1和300nM分別是TRAIL和XIAP-ASODN下調(diào)XIAP表達、抑制膠質(zhì)母細胞瘤增殖的最佳濃度。 5．TRAIL聯(lián)合XIAP-A