長非編碼RNA在脂肪干細胞脂向分化的差異性表達分析.pdf

1、[目的]
　　成脂分化是一個復(fù)雜的過程的，涉及激素刺激，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，基因表達及細胞形態(tài)學(xué)改變，整個成脂分化是一個由許多轉(zhuǎn)錄因子參與形成的網(wǎng)絡(luò)。lncRNAs可在不同的生物進化過程中發(fā)揮作用，包括細胞周期調(diào)控，免疫監(jiān)視，胚胎干細胞多能性等，然而其在成脂分化的分子機制仍未清楚。本研究通過人脂肪來源干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)定向脂向誘導(dǎo)分化，成功鑒定后應(yīng)用高通量篩選技術(shù)篩選出有差異表達的ln

2、cRNAs，并預(yù)測其作用的靶基因。初步建立ADSCs脂向分化中l(wèi)ncRNAs的相關(guān)調(diào)控基因、細胞因子表達的網(wǎng)絡(luò)，找出lncRNAs在成脂分化過程中的啟動機制及調(diào)控通道，為肥胖癥的基礎(chǔ)治療提供理論依據(jù)。
　　[方法]
　　組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)3例健康人的ADSCs，對第三代細胞進行流式細胞儀鑒定。每例細胞標本隨機分成三組（0 d、5d和12 d），分別成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)5d和12d后進行油紅O染色鑒定。對所有樣本進行總RNA抽提及質(zhì)量檢

3、測。對每個樣本約5μg總RNA進行標記及列陣雜交，應(yīng)用Axon GenePix4000B微陣點掃描儀掃描芯片的熒光強度。掃描圖像輸入NimbleScan2.5軟件進行網(wǎng)格定測和數(shù)據(jù)表達分析，通過分位數(shù)標準化和軟件內(nèi)置的穩(wěn)定多片平均值(RMA)對表達數(shù)據(jù)進行標準化，所有的lncRNAs被輸入到軟件Agilent GeneSpring GX11.5.1中進行l(wèi)ncRNAs差異表達譜篩選。每個樣本重復(fù)篩選3次，將lncRNAs的所有目標值的標

4、準化值≥100挑選出進行數(shù)據(jù)分析。最后分層聚類分析有差異表達的lncRNAs的表達模型。
　　[結(jié)果]
　　第3代ADSCs代表面抗原表達CD29，CD44，CD90，CD105表達陽性。CD34，CD45，CD106表達陰性。第3代人脂肪干細胞經(jīng)成脂誘導(dǎo)劑分別培養(yǎng)5d,12 d后用油紅O染色，計數(shù)脂滴數(shù)量，第5d和第12 d的脂肪顆粒數(shù)是5％和41％。第3代人脂肪干細胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)后倒置相差顯微鏡下觀察，茜素紅染色陽性

5、。總RNA抽提及質(zhì)量檢測結(jié)果所有樣本A260/A280值在1.80～2.10，均符合要求。對掃描超過1800個人lncRNAs表達譜篩選，人工分析出5個3.0倍以上持續(xù)上調(diào)的lncRNAs和4個3.0倍以上持續(xù)下調(diào)的lncRNAs，其中6個有對應(yīng)的靶基因，3個沒有靶基因，只有LncRNAs所在染色體的位置和序列。
　　[結(jié)論]
　　本研究通過對人脂肪來源間充質(zhì)干細胞脂向誘導(dǎo)分化的lncRNAs篩選，得出差異性表達譜，它們可能