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1、近年來(lái),細(xì)菌對(duì)各類抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性發(fā)展迅速,耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、耐青霉素肺炎鏈球菌(PRSP)、多重耐藥性結(jié)核桿菌尤其是耐萬(wàn)古霉素腸球菌(VRE)的出現(xiàn),給臨床治療造成了困難。由于現(xiàn)有藥物較難控制耐藥菌感染,研制抗耐藥菌藥物已經(jīng)成為藥學(xué)領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)的目的是建立植物和內(nèi)生菌提取物庫(kù),以細(xì)菌、細(xì)菌外排泵及β-內(nèi)酰胺酶為靶點(diǎn),篩選對(duì)耐藥菌有抗菌作用的樣本,通過(guò)活性跟蹤分離,得到活性單體或組分,為研制新的抗耐藥菌
2、藥物奠定基礎(chǔ)。 植物及植物內(nèi)生菌的次生代謝產(chǎn)物是一個(gè)龐大的化合物庫(kù),是發(fā)現(xiàn)新的抗菌物質(zhì)的天然資源。本實(shí)驗(yàn)的樣本庫(kù)由植物及植物內(nèi)生菌的提取物組成,共300個(gè)個(gè)樣本。 以臨床分離的金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、銅綠假單胞菌耐藥菌株為靶點(diǎn),采用Kirby-Barer紙片法及藥基法進(jìn)行篩選,發(fā)現(xiàn)橙色串珠霉(M.erythraea Sh.Et Dodge)的菌絲提取物具有較強(qiáng)的抑菌活性,用TLC進(jìn)行活性跟蹤、柱色譜分離,得到具有
3、抗菌活性的單體化合物1,根據(jù)化合物1的1H、13C NMR譜及高分辨質(zhì)譜,鑒定為21,25-二甲基-24-乙基-8,15,22-三烯-3β-甾醇。檢測(cè)了化合物1對(duì)9株細(xì)菌的MIC濃度,在8-128μg/ml之間,對(duì)G+菌的抑制效果強(qiáng),為殺菌作用,對(duì)G-菌的抑制效果較弱,對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC25923及耐藥株的MIC、MBC濃度相同,說(shuō)明敏感株和耐藥株存在共同靶位。用金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、銅綠假單胞菌耐藥菌株感染小鼠,化合物
4、1的保護(hù)率在70-100%之間,呈明顯的量-效關(guān)系?;衔?屬于甾醇類化合物,毒性低(化療指數(shù)﹥7),尚無(wú)類似結(jié)構(gòu)的抗菌藥物上市,因此,可作為抗菌先導(dǎo)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾,值得進(jìn)一步研究。 將抗菌藥物泵出胞外是細(xì)菌廣泛存在的耐藥機(jī)制,抑制細(xì)菌外排泵(efflux pump),可以增加細(xì)菌胞內(nèi)藥物濃度,使耐藥菌恢復(fù)對(duì)原抗菌藥物的敏感性。以小蘗堿為細(xì)菌外排泵底物,建立細(xì)菌外排泵抑制劑雙平板篩選模型,從樣本庫(kù)中篩選出白前、牡丹皮乙醇提取物及
5、橙色串珠霉菌液提取物,經(jīng)活性跟蹤分離,得到化合物2、3、4三個(gè)抑制細(xì)菌外派泵的活性單體,通過(guò)波譜解析,其結(jié)構(gòu)鑒定為:2,4-二羥基苯乙酮(化合物2)、5,7-二羥基-4′-羥甲基異黃酮(化合物3)、2-羥基-4-甲氧基苯乙酮(化合物4)。體外試驗(yàn)表明,三種化合物均能提高耐藥菌對(duì)環(huán)丙沙星、紅霉素、四環(huán)素、小蘗堿的敏感性。體內(nèi)抗耐藥菌感染試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),化合物2可能存在神經(jīng)毒性,化合物4可以抑制動(dòng)物細(xì)胞外排泵,不是細(xì)菌外排泵專一性抑制劑,化合物3
6、能提高環(huán)丙沙星對(duì)感染小鼠的保護(hù)率。測(cè)定細(xì)菌胞內(nèi)小蘗堿的相對(duì)熒光強(qiáng)度,表明化合物2、3、4對(duì)細(xì)菌外排泵有抑制作用?;衔?屬黃酮類化合物,安全無(wú)毒,可以作為抗菌藥物增敏劑。 很多病原菌能分泌β-內(nèi)酰胺酶(β-lactamase),將β-內(nèi)酰胺類抗菌素水解失活,β-內(nèi)酰胺酶抑制劑可以提高產(chǎn)酶菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌素的敏感性。本實(shí)驗(yàn)從銅綠假單胞菌耐藥株分離純化了一種β-內(nèi)酰胺酶,按Bush-Jacoby-Medeiros分類方法,屬2
7、br酶。首次建立了β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的Starch-iodine平板篩選模型,從樣本庫(kù)中篩選到2種提取物,活性跟蹤分離,得到單體化合物5、6,經(jīng)波譜解析,鑒定為酒石酸、水楊酸。另從39種化合物中篩選出2個(gè)具有很強(qiáng)抑制活性的化合物,其中二硫聯(lián)苯體內(nèi)外試驗(yàn)都能提高甲氧西林的抗菌活性。以該酶為靶點(diǎn),初步對(duì)水楊酸極其類似物的抑酶活性進(jìn)行構(gòu)效關(guān)系分析,表明水楊酸苯環(huán)上的羥基和羧基是活性基團(tuán)之一,在苯環(huán)上增加羧基取代基可以較大提高抑酶活性,增加磺酸
8、基、硝基能提高抑酶活性,苯環(huán)上的氨基降低抑酶活性。為設(shè)計(jì)新的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑奠定了基礎(chǔ)。 多糖廣泛存在于植物中,但植物多糖抗細(xì)菌感染方面的研究不多,本課題研究了雞屎藤、白前粗多糖的體內(nèi)抗耐藥菌感染效果。用沙門氏菌感染小鼠,感染前給藥時(shí),雞屎藤粗多糖對(duì)感染小鼠的保護(hù)率為83%,白前粗多糖為66%,保護(hù)率隨多糖樣品含糖量的增加而提高;感染時(shí)同時(shí)給藥,兩種粗多糖的保護(hù)率均下降。雞屎藤、白前粗多糖均能提高感染小鼠紅細(xì)胞C3b受體活性,
9、提高小鼠清除抗原-抗體復(fù)合物的功能,提高嗜中性白細(xì)胞的吞噬活性,提高血清中特異性抗體的滴度。因此,粗多糖對(duì)小鼠的保護(hù)作用與提高免疫功能有關(guān)。 采用GC-MS技術(shù),分析了油茶樹、白前揮發(fā)油的化學(xué)組成。油茶樹揮發(fā)油能抑制耐藥菌的生長(zhǎng),殺菌曲線表明,當(dāng)濃度為2×MIC時(shí),6 h殺死金黃色葡萄球菌,24 h殺死銅綠假單胞菌。抗菌活性成分估計(jì)是芳樟醇、壬醛、萜品醇、水楊酸甲酯等化合物。白前揮發(fā)油無(wú)抑菌活性,但能明顯降低雞胚中雞傳染性支氣管
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