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文檔簡介
1、目的:
1.研究NK 細(xì)胞功能與HCV感染及抗病毒治療后不同轉(zhuǎn)歸間的關(guān)系;
2.比較丙型肝炎患者NK細(xì)胞功能的體內(nèi)外差異;
3.探討丙肝患者抗病毒治療過程中NK 細(xì)胞功能的動態(tài)變化及其與病毒載量、基因型的關(guān)系。
方法:
1.病例:(1)慢性HCV 感染患者49例,其中未治療者30例,應(yīng)用IFN-α聯(lián)合利巴韋林治療者19例(2)感染HCV后自發(fā)清除病毒者5例(3)經(jīng)過抗
2、病毒治療后持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答患者18例(4)經(jīng)過抗病毒治療后非持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答患者17例(5)
健康對照18例。已排除其它病毒合并感染,取外周肝素鈉抗凝血備檢。
2.采用ELISA 檢測HCV 抗體,序列特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)(SSP-PCR)方法檢測HCV基因分型。應(yīng)用Real time-PCR 定量檢測HCV-RNA 水平,包括未治療、治療后持續(xù)或非持續(xù)應(yīng)答及自發(fā)恢復(fù)的丙肝患者在入組時;接受治療的病人在治療前及
3、治療4周、12周、24周時間點。
3.采用易得人淋巴細(xì)胞分離管分離出外周血單個核細(xì)胞(PBMC),利用CFSE/PI染色方法檢測NK 細(xì)胞對K562 細(xì)胞的殺傷活性。
4.流式染色技術(shù)檢測NK 細(xì)胞及其亞型的頻率,NK 細(xì)胞表面激活及抑制性受體的頻率,細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色檢測細(xì)胞因子IFN-γ及TNF-α的分泌情況。
5.將一部分健康對照及慢性丙肝患者分離出的PBMC 加入細(xì)胞因子(rh IL-2
4、及rh IL-15)進(jìn)行體外培養(yǎng),72h后檢測NK 細(xì)胞表面受體及分泌細(xì)胞因子的變化。
6.Flowjo Software 對流式圖進(jìn)行處理,SPSS13.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,p值<0.05認(rèn)為有顯著差異性。
結(jié)果:
1.慢性HCV 感染及治療后不同轉(zhuǎn)歸患者組間NK 細(xì)胞、亞型、表面受體、殺傷活性及分泌細(xì)胞因子頻率的比較:
(1)慢性丙肝患者外周血NK 細(xì)胞殺傷活性,表達(dá)受體N
5、KG2D及分泌細(xì)胞因子IFN-γ,TNF-α頻率明顯低于健康對照組(p<0.01),受體NKG2C顯著低于自發(fā)恢復(fù)組(p<0.01);受體NKp30,NKp44及NKG2A 顯著低于持續(xù)應(yīng)答組(p<0.05)。
(2)與治療后持續(xù)應(yīng)答患者相比,非持續(xù)應(yīng)答者NK細(xì)胞殺傷活性顯著減低(p<0.01);此外其殺傷活性,受體NKG2D及分泌細(xì)胞因子IFN-γ,TNF-α頻率明顯低于健康對照,受體NKG2A 則相反(p<0.05)。
6、
(3)持續(xù)應(yīng)答患者NK 細(xì)胞表面活化性受體NKp46,NKp30,NKp44,NKG2D及NKG2A 與較非持續(xù)應(yīng)答者高,分泌細(xì)胞因子IFN-γ,TNF-α能力亦較強,但沒有達(dá)到統(tǒng)計學(xué)差異。
(4)自發(fā)恢復(fù)的HCV 感染者外周血NK 細(xì)胞、受體NKp46、NKG2C及分泌細(xì)胞因子TNF-α頻率高于非持續(xù)應(yīng)答患者(p<0.05)。
2.體外培養(yǎng)后,慢性HCV 感染患者NK 細(xì)胞頻率降低,顯著低于
7、健康對照組培養(yǎng)以后(p<0.01),但受體NKG2A及NKG2C 頻率增加,高于健康對照組(p<0.05)。
非持續(xù)應(yīng)答組細(xì)胞體外培養(yǎng)后,NK 細(xì)胞分泌IFN-γ及TNF-α均低于健康對照組培養(yǎng)后(p<0.05)。
3.慢性丙肝患者及非持續(xù)應(yīng)答患者血清病毒滴度及ALT 水平與NK 細(xì)胞功能無相關(guān)性。
4.慢性丙肝患者治療過程中NK 細(xì)胞、亞型及表面受體的頻率和功能活性變化:
(1)
8、低病毒載量及非基因1 型患者CD56 dim NK 細(xì)胞頻率下降,CD56 bright NK 細(xì)胞頻率增加。(2)低病毒載量及非基因1 型患者抑制性受體NKG2A 頻率增加,高病毒載量及基因1 型患者活化性受體NKG2D 減少。
(3)高病毒載量及基因1 型患者NK 細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFN-γ,TNF-α能力下降。
結(jié)論:
1.NK 細(xì)胞功能與HCV 感染及治療后轉(zhuǎn)歸有關(guān),慢性HCV 感染者體
9、內(nèi)NK 細(xì)胞功能受損,自發(fā)恢復(fù)者及治療持續(xù)應(yīng)答患者NK 細(xì)胞活性高于慢性丙肝患者及非持續(xù)應(yīng)答患者。
2.慢性丙肝患者體內(nèi)外NK 細(xì)胞功能與健康人存在差別。
3.慢性丙肝患者及非持續(xù)應(yīng)答患者血清病毒滴度、ALT水平與NK細(xì)胞功能無相關(guān)性。
4.與低病毒載量及非基因1型患者相比,高病毒載量及基因1型患者在抗病毒治療過程中NK 細(xì)胞功能活性沒有得到改善甚至降低。
本課題的創(chuàng)新點:
10、 1.比較系統(tǒng)地研究了NK 細(xì)胞功能活性與HCV 感染及治療后轉(zhuǎn)歸的關(guān)系。
2.對丙肝患者體內(nèi)外NK 細(xì)胞功能的對比研究有助于進(jìn)一步認(rèn)識NK 細(xì)胞功能與HCV感染的關(guān)系。
3.動態(tài)監(jiān)測丙肝患者抗病毒治療過程中NK 細(xì)胞功能的變化,以期預(yù)測患者對治療的應(yīng)答及治療后的轉(zhuǎn)歸。
本課題研究的意義:
1.研究結(jié)果顯示NK 細(xì)胞功能對HCV 感染后轉(zhuǎn)歸及抗病毒治療效果均有直接影響,有助于
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