新型結(jié)核疫苗p846的保護作用及其機制探討.pdf

1、目的：構(gòu)建結(jié)核新型DNA疫苗pcDNA3.1-Rv3615c-Mtb10.4-Rv2660c(p846)，評價其在抗結(jié)核感染中的保護作用，并探討發(fā)揮該保護作用的潛在機制。
　　方法：通過分子生物學的方法構(gòu)建含有結(jié)核桿菌三抗原融合表達質(zhì)粒p846及單個抗原表達的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Rv3615c(pRv3615c)，pcDNA3.1-Mtb10.4(pMtb10.4)和pcDNA3.1-Rv2660c(pRv2660c)，測序

2、鑒定正確后體外轉(zhuǎn)染293T細胞，western blot鑒定其在真核細胞內(nèi)的表達。同時構(gòu)建三個單抗原及融合抗原846的原核表達質(zhì)粒，并應(yīng)用GST標簽和His標簽Ni柱親和層析技術(shù)進行相關(guān)蛋白純化。將成功構(gòu)建的三抗原融合基因疫苗和單抗原疫苗以肌肉注射的方式對小鼠進行免疫，具體免疫方式如下：選擇6-8周齡雌性BALB/c小鼠，隨機分成6組，每組20只：p846組，pRv3615c組，pMtb10.4組，pRv2660c組，空載體pcDNA3

3、.1組及BCG陽性對照組，每只小鼠每次使用50μg的重組質(zhì)粒于0、2、4、6周進行免疫，其中BCG組在0周以5×106CFU的劑量皮下免疫一次。對免疫小鼠每隔兩周進行一次血清中IgG抗體檢測。末次免疫后兩周，檢測相應(yīng)的細胞免疫應(yīng)答類型：包括ELISPOT檢測產(chǎn)生IFN-γ的T細胞數(shù)量、Brdu試劑盒檢測T細胞增殖、LDH的釋放檢測T細胞的殺傷活性、流式細胞儀及ELISA檢測相關(guān)的細胞因子等。末次免疫后4周，進行BCG攻毒，并于攻毒后的4

4、-6周進行該疫苗的保護性實驗檢測（組織病理切片和CFU實驗等），免疫后未攻毒的各組小鼠再繼續(xù)飼養(yǎng)用于相關(guān)的記憶性T細胞的檢測。
　　結(jié)果：
　　1.構(gòu)建了結(jié)核桿菌三抗原融合DNA疫苗p846，和單抗原DNA疫苗pRv3615c，pMtb10.4，pRv2660c及其原核表達質(zhì)粒；
　　2.細胞免疫應(yīng)答檢測結(jié)果如下：
　　1）特異性T淋巴細胞增殖ELISA（Brdu）實驗發(fā)現(xiàn)，構(gòu)建的p846融合抗原疫苗可有效促進T

5、細胞的特異性增殖，尤其在滅活的H37Rv和TFP846蛋白的刺激下，其OD值達2.5左右，顯著高于單抗原疫苗組和空載體組（p<0.05）；
　　2）IFN-γ的ELISPOT檢測結(jié)果顯示，與單抗原疫苗免疫組相比，三抗原融合基因疫苗p846可大量促進分泌IFN-γ的T細胞的產(chǎn)生；脾臟培養(yǎng)上清相關(guān)細胞因子的檢測，發(fā)現(xiàn)p846疫苗免疫組顯著增加了Th1型細胞因子如IFN-γ和TNF-α的分泌，同時也促進了和Th1型應(yīng)答密切相關(guān)的細胞因子

6、IL-2和IL-17A的產(chǎn)生，與ELISPOT結(jié)果相一致；
　　3）通過胞內(nèi)染色分析了p846疫苗誘生的體內(nèi)特異性CD4+和CD8+T細胞的產(chǎn)生情況，發(fā)現(xiàn)p846疫苗免疫組脾臟CD4+IFN-γ+和CD8+IFN-γ+T細胞比例分別為6.45%和7.61%；CD4+IL-2+和CD8+IL-2+T細胞比例分別為24.1%，20.2%；CD4+TNF-α+和CD8+TNF-α+T細胞比例分別為59.3%，71.3%，相對單抗原疫苗組

7、(尤其是CD4+T細胞)均有顯著統(tǒng)計學差異（p<0.05）；
　　3.體液免疫應(yīng)答檢測結(jié)果：通過小鼠血清中IgG抗體的檢測發(fā)現(xiàn)p846疫苗可以誘生大量的高親和力抗體的產(chǎn)生，OD值達3.25左右，滴度達1:4500，且主要以IgG2a亞型為主；
　　4.組織病理切片HE染色的結(jié)果顯示，攻毒后6周，p846疫苗免疫的小鼠：大部分肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡腔內(nèi)充血、出血明顯減少，肺間質(zhì)內(nèi)僅有少量炎性細胞浸潤；而單抗原疫苗組及空載體組的小鼠

8、：大部分肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔內(nèi)有大量充血、出血且有大量炎性細胞浸潤；
　　5.肺臟和脾臟CFU的結(jié)果顯示，p846疫苗免疫組小鼠肺部結(jié)核菌載量即Log10CFU約為3.50，脾臟的Log10CFU約為2.70，相對于單抗原疫苗組（其中肺臟Log10CFU約為5.5，脾臟的Log10CFU約為5.0），有顯著性差異(p<0.05)；
　　6.記憶性T細胞檢測顯示p846疫苗可顯著促進效應(yīng)型記憶性CD4+T（CD25-CD44+

9、CD62L-CCR7-）細胞的產(chǎn)生，其值可達53.6%，相對于單抗原疫苗組pRv3615c的46.1%，pMtb10.4的45.5%，pRv2660c的41.0%和空載組的37.3%，有顯著統(tǒng)計學差異（p<0.05）。
　　結(jié)論：我們構(gòu)建的新型結(jié)核三抗原融合DNA疫苗p846免疫小鼠后，不僅能誘生強烈的細胞免疫應(yīng)答和一定的體液免疫應(yīng)答，還能有效的發(fā)揮抗結(jié)核桿菌感染的作用，也可有效促使效應(yīng)型記憶性CD4+T細胞的產(chǎn)生，且保護效果優(yōu)于