動(dòng)物模型驗(yàn)證CA916798基因通過PI3K-AKT通路參與順鉑耐藥.pdf

1、背景：
　　肺癌是當(dāng)前世界上對(duì)人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率已躍居各類惡性腫瘤的前列。多藥耐藥(Multidrug resistance,MDR)可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)多種結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的抗癌藥物產(chǎn)生耐受性,是肺癌化療失敗的主要原因之一。深入研究肺癌MDR的發(fā)生機(jī)制,有助于為臨床逆轉(zhuǎn)肺癌MDR提供新的治療靶點(diǎn)。
　　順鉑(cis-dichlorodiamine platinum,CDDP)是肺癌化療中有

2、效并廣泛使用的一線藥物,主要通過抑制腫瘤細(xì)胞DNA的合成[1]、誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[2]而發(fā)揮作用。肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐受是肺癌患者化療效果不盡人意的重要原因。目前研究認(rèn)為,損傷修復(fù)過程中DNA剪切物的增加、抗凋亡、與調(diào)控信號(hào)通路相關(guān)的調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)的改變、藥物攝取減少導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)CDDP濃度降低等均可能與對(duì)順鉑的耐藥有關(guān)[1-5]。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),肺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物耐受的機(jī)制是一個(gè)多基因參與的復(fù)雜事件,而且不同的藥物誘導(dǎo)的肺癌MDR的機(jī)制不盡

3、相同[1,3-6],而到目前為止肺癌MDR的機(jī)制仍未完全闡明,因此,尋找新的耐藥相關(guān)基因并進(jìn)行深入研究,有助于為臨床逆轉(zhuǎn)肺癌MDR提供新的治療靶點(diǎn)。
　　CA916798基因是我們課題組在前期研究工作中,通過抑制消減雜交(SSH)技術(shù)從人肺腺癌MDR細(xì)胞系SPC-A-1/CDDP中首先克隆表達(dá)的新基因,已登錄于GenBank的EST庫(kù),并證實(shí)其與肺癌順鉑耐藥相關(guān)。前期研究發(fā)現(xiàn):CA916798基因高表達(dá)于肺癌耐藥細(xì)胞系;CA916

4、798基因的作用與PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有密切關(guān)系:抑制PI3K、AKT或肺癌耐藥相關(guān)基因CA916798均可以逆轉(zhuǎn)多藥耐藥肺腺癌細(xì)胞A549/CDDP對(duì)CDDP的耐藥性,反之,激活A(yù)KT或增加CA916798基因的表達(dá),則可以增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對(duì)CDDP的耐受,初步證明肺癌耐藥相關(guān)基因CA916798很可能就是PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路作用的底物或靶點(diǎn)。本課題通過探討CA916798基因?qū)樸K的耐藥機(jī)制,為進(jìn)一步明確CA916

5、798基因MDR機(jī)理進(jìn)而尋找新的肺癌治療途徑奠定理論基礎(chǔ)。
　　目的:
　　在動(dòng)物體內(nèi)驗(yàn)證PI3K/AKT/mTOR/P70S6K1信號(hào)通路和CA916798基因在肺癌順鉑耐藥中的作用以及它們之間的相互關(guān)系。
　　方法:
　　1.建立A549、A549/CDDP裸鼠移植瘤模型。
　　2.將裸鼠分為以下6組:A549組,A549/CDDP組,A549+LY294002組,A549/CDDP+LY294002組

6、,A549+LY294002+雷帕霉素組,A439/CDDP+LY294002+雷帕霉素組。
　　3.分別觀測(cè)加入順鉑、PI3K的抑制劑LY294002、mTOR的抑制劑雷帕霉素聯(lián)合LY294002后各組裸鼠的一般情況和腫瘤生長(zhǎng)情況。
　　4.測(cè)量各組裸鼠腫瘤大小,進(jìn)行腫瘤大體觀察、組織病理切片HE染色和免疫組化,檢測(cè)各組腫瘤組織中CA916798、AKT、mTOR、P70S6K1mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:

7、r>　　1.成功建立A549、A549/CDDP裸鼠移植瘤模型。
　　2.通過測(cè)量腫瘤大小及腫瘤大體觀察發(fā)現(xiàn):①A549/CDDP組移植瘤體積大于A549組;②用LY294002、雷帕霉素聯(lián)合LY294002阻斷PI3K/AKT通路后,A549組和A549/CDDP組移植瘤體積明顯縮小。
　　3.免疫組化結(jié)果表明:①A549/CDDP組腫瘤組織中CA916798、AKT、mTOR的蛋白表達(dá)量均高于A549組,p<0.05;②

8、經(jīng)LY294002或聯(lián)合雷帕霉素作用后,A549/CDDP組和A549組腫瘤組織中CA916798、AKT、mTOR的蛋白表達(dá)量下降,與對(duì)照組相比,p<0.05。
　　5.采用RT-PCR檢測(cè)各組A549和A549/CDDP腫瘤組織中CA916798、AKT、mTORmRNA表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn):①A549/CDDP組的表達(dá)量均高于A549組,p<0.05;②用LY294002或聯(lián)合雷帕霉素作用后,A549組和A549/CDDP組的表達(dá)

9、量均下降,與對(duì)照組相比,p<0.05。
　　6.通過Western blot檢測(cè)證實(shí):①A549/CDDP組CA916798、AKT、mTOR、P70S6K1的蛋白表達(dá)量均高于A549組,p<0.05;②采用LY294002或雷帕霉素聯(lián)合LY294002作用阻斷PI3K/AKT/mTOR通路后,A549組和A549/CDDP組CA916798、AKT、mTOR、P70S6K1的蛋白表達(dá)量均下降,與對(duì)照組比較,p<0.05。