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1、目的:本課題旨在建立小鼠后足癌痛模型的基礎(chǔ)上,從β-END的表達(dá)初步探討華蟾素治療癌痛的外周機(jī)制。
方法:1、小鼠后足癌痛模型的制作:選擇22只雌性昆明小鼠,向右后足足底注射H22肝癌細(xì)胞懸液,同時(shí)向左后足足底注射生理鹽水作為對(duì)照,每只小鼠的右足和左足在造模前、造模后第2、4、6、8、10、12、20、30天分別進(jìn)行后足痛行為和足腫脹測(cè)定,并按照一定時(shí)間頸椎脫臼處死小鼠取其右足做HE染色,進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀(guān)察。
2、華蟾素
2、治療癌痛模型小鼠的外周機(jī)制:將60只雌性昆明小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、華蟾素組、華蟾素聯(lián)合NAL-M組和嗎啡組,每組12只。除正常組的小鼠的右后足注射生理鹽水外,其余各小鼠的右后足足底均注射H22肝癌細(xì)胞懸液。從造模第9天開(kāi)始給藥,正常對(duì)照組腹腔注射生理鹽水,后足癌痛模型組分別用生理鹽水聯(lián)合生理鹽水腹腔注射、華蟾素注射液聯(lián)合生理鹽水、華蟾素注射液聯(lián)合外周阿片受體拮抗劑NAL-M和嗎啡聯(lián)合生理鹽水,連用8天;各組小鼠在造模前、造模后
3、第2、4、6、8天以及給藥第2、4、6、8天分別進(jìn)行后足痛行為測(cè)定。給藥的最后一天稱(chēng)取體重、痛行為測(cè)定結(jié)束后,處死動(dòng)物,取標(biāo)本檢測(cè)。取脾和胸腺并稱(chēng)重,計(jì)算脾和胸腺指數(shù)。按組織切片要求留取右后足腫瘤及周?chē)M織標(biāo)本;用ELISA法測(cè)定右后足腫瘤及周?chē)M織勻漿液和血漿中β-END、CRF、IL-1β的含量;免疫組化法檢測(cè)右后足腫瘤及周?chē)M織中β-END、POMC和μ-阿片受體的表達(dá)。
結(jié)果:1、小鼠后足癌痛模型的制作結(jié)果:與左后足比
4、較,右后足既表現(xiàn)了熱痛覺(jué)過(guò)敏,又表現(xiàn)出了機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏,同時(shí)還出現(xiàn)了“鏡像痛”現(xiàn)象。后足的形態(tài)學(xué)觀(guān)察發(fā)現(xiàn),右后足癌細(xì)胞最終侵潤(rùn)到骨。
2、痛行為測(cè)定結(jié)果:與正常對(duì)照組比較,模型組右后足在造模后的第4天既表現(xiàn)了熱痛覺(jué)過(guò)敏(p<0.01),又表現(xiàn)出了機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏(p<0.01)。華蟾素可顯著改善癌痛小鼠的痛行為,顯著的提高模型鼠的熱痛覺(jué)閾值和機(jī)械性痛閾值(p<0.05或p<0.01),但沒(méi)有嗎啡的起效作用快而強(qiáng)。而外周阿片受體拮
5、抗劑NAL-M能夠消除華蟾素的鎮(zhèn)痛作用。
3、脾和胸腺指數(shù)測(cè)定結(jié)果:與正常對(duì)照組比較,模型組的脾和胸腺指數(shù)顯著地降低(p<0.05或p<0.01)。華蟾素可顯著提高癌痛小鼠脾和胸腺指數(shù)(p<0.05或p<0.01)。
4、右后足腫瘤及周?chē)M織勻漿和血漿中β-END、CRF、IL-1β的含量測(cè)定結(jié)果:與正常對(duì)照組比較,模型組腫瘤及周?chē)M織勻漿中的CRF、IL-1β的含量可顯著增高(p<0.05或p<0.01)。相比之下
6、,β-END的含量則顯著降低(p<0.05或p<0.01)。華蟾素可顯著提高腫瘤及周?chē)M織勻漿中的β-END、CRF的含量(p<0.05或p<0.01),而對(duì)血漿中β-END、CRF、腫瘤及周?chē)M織勻漿和血漿中的IL-1β的含量影響較小。
5、右后足腫瘤及周?chē)M織中β-END、POMC和μ-阿片受體的表達(dá)結(jié)果:免疫組化結(jié)果顯示,正常對(duì)照組中的小鼠足組織中β-END、POMC和μ-阿片受體的表達(dá)均較高,而癌痛模型小鼠的足腫瘤及周
7、圍組織中的β-END、POMC和μ-阿片受體的表達(dá)顯著下降,且與正常組比較,具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。而華蟾素則可顯著地提高癌痛小鼠腫瘤及周?chē)M織中β-END、POMC和μ-阿片受體的表達(dá),且與模型組比較,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。
結(jié)論:1、本實(shí)驗(yàn)制備的癌痛模型既表現(xiàn)了熱痛覺(jué)過(guò)敏,又表現(xiàn)出了機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏,同時(shí)還出現(xiàn)了“鏡像痛”現(xiàn)象。后足的形態(tài)學(xué)觀(guān)察發(fā)現(xiàn),右后足癌細(xì)胞最終侵潤(rùn)到骨,說(shuō)明該癌痛模型制備較為成功,
8、可作為研究治療癌痛藥物的模型。
2、華蟾素能夠改善癌痛模型小鼠的癥狀,顯著提高癌痛小鼠的痛閾值,其機(jī)制可能與增加腫瘤及周?chē)M織中β-END的含量有關(guān),具體如下:可提高癌痛小鼠的脾和胸腺指數(shù),增強(qiáng)癌痛小鼠的免疫功能;可提高癌痛小鼠足腫瘤及周?chē)M織中POMC的表達(dá)、CRF的含量,增加β-END的合成以及釋放,從而增加腫瘤及周?chē)M織中β-END的含量;可增加腫瘤及周?chē)M織中μ-阿片受體的表達(dá),最終增加β-END與μ-阿片受體在腫瘤及
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