eNOS在高糖誘導(dǎo)的RMC中的表達(dá)及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景及目的： 糖尿病腎病是糖尿病的重要并發(fā)癥和致死原因，也是造成慢性腎功能衰竭的常見原因。大約有30％胰島素依賴型（1 型）和5-30％非胰島素依賴型（2 型）糖尿病患者發(fā)展成為糖尿病腎臟疾病。在糖尿病腎病的初期是以腎小球?yàn)V過率的增加或超濾過為特征，之后逐漸發(fā)展成為終末期腎功能衰竭。 研究表明，由內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthases，eNOS）和神經(jīng)元型一氧化氮合

2、酶誘導(dǎo)的一氧化氮(nitric oxide，NO)的產(chǎn)生與糖尿病腎臟的超濾過有關(guān)。關(guān)于eNOS 的表達(dá)和NO 的產(chǎn)生在腎臟的內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞已有研究，而在腎小球系膜細(xì)胞中的研究至今仍未發(fā)現(xiàn)。該實(shí)驗(yàn)以大鼠腎小球系膜細(xì)胞（rat mesangial cell，RMC）為模型細(xì)胞，研究高糖誘導(dǎo)的eNOS 的表達(dá)和NO 的產(chǎn)生。 方法： 大鼠腎小球系膜細(xì)胞（RMC）常規(guī)培養(yǎng)在含5.5mM葡萄糖的RPMI 1640培養(yǎng)液中，用

3、胰蛋白酶－EDTA混合消化酶傳代；用[Ca2+]I顯示劑Fura-2 AM（1μM）和NO顯示劑DAF-2 DA（0.5nM）雙標(biāo)記RMC，[Ca2+]I和NO的變化用QM-6熒光計(jì)同步測定；用RT、Real Time－PCR和Western Blot測定eNOS的蛋白和mRNA相對(duì)含量；構(gòu)建質(zhì)粒pDsRed eNOS，并建立穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染RMC系，應(yīng)用激光共聚焦觀察記錄轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，用分光光度計(jì)測定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光表達(dá)。 各項(xiàng)參數(shù)均

4、以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean ± S)表示，采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），多重比較采用Dunnett t/Tamhane,s T2 方法。顯著性水平α=0.05。 結(jié)果： 在腎小球系膜細(xì)胞中，高糖明顯增加eNOS的表達(dá)(p<0.05)，并有一定的量效、時(shí)效關(guān)系，同時(shí)可促進(jìn)NO的產(chǎn)生；放線菌酮可以抑制eNOS的蛋白合成；高糖對(duì)eNOS的作用不受其磷酸化的影響；PKC和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶抑制劑對(duì)eNOS的蛋

5、白合成沒有影響；脫氧葡萄糖可以與葡萄糖競爭而抑制eNOS的表達(dá)；高糖對(duì)eNOS表達(dá)的調(diào)節(jié)與eNOS mRNA的穩(wěn)定性沒有明顯關(guān)系；高糖明顯增加eNOS啟動(dòng)子的活性(p<0.05)。 結(jié)論： 首次檢測出eNOS在RMC中的表達(dá)，并觀察到高糖可以上調(diào)eNOS mRNA和蛋白的表達(dá)，同時(shí)可以促進(jìn)NO的產(chǎn)生；第一次構(gòu)建了一個(gè)包含了1.6kb片段的大鼠eNOS啟動(dòng)子的pDsRed eNOS表達(dá)載體，并建立了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系；從而