Free β-hCG和PAPPA光激化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑的研制.pdf

1、研究背景及目的:
　　 唐氏綜合征(Down'S Syndrome，DS)又稱先天愚型，是一種發(fā)生于胎兒的遺傳性疾病，其發(fā)病率在新生兒中約為1/600-1/800，據(jù)初步統(tǒng)計，我國每年出生唐氏綜合征患兒約2.7萬，平均每20min就有1例出生，占智能發(fā)育不全患兒的10％。DS是一種最常見的染色體遺傳病，是由于第21對染色體異常導(dǎo)致的胎兒智力發(fā)育障礙，其主要特征為嚴重的先天性智力障礙、特殊面容，并多伴有嚴重的心臟病或多發(fā)畸形，生活

2、不能自理。目前唐氏綜合征還無法治療，患兒的出生將給社會和家庭帶來極大的經(jīng)濟負擔(dān)和精神壓力。近年來優(yōu)生優(yōu)育的觀念被大部分人接受，完善產(chǎn)前檢查成為需要，唐氏綜合征篩查也成為了熱點。如何在產(chǎn)前發(fā)現(xiàn)唐氏綜合征胎兒，防止和降低唐氏患兒的出生，是當(dāng)前產(chǎn)前篩查提高我國出生人口素質(zhì)的重要任務(wù)。
　　 大約10年前于妊娠中期利用孕婦血清中甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)、人絨毛促性腺激素(human chorionic go

3、nadotropin，HCG)、游離雌三醇(unconjugated oestriol，uE3)等標記物產(chǎn)前篩查胎兒Down綜合征(DS)的方法已在國際上得到公認。但孕中期篩查并發(fā)現(xiàn)DS后需引產(chǎn)，而孕早期篩查并發(fā)現(xiàn)DS比之孕中期具有能盡早減輕病人因引產(chǎn)而帶來的精神和肉體的痛苦等優(yōu)點，故受到人們的關(guān)注，之后Wald等及Haddow等綜合了9個國家21個產(chǎn)前診斷中心的研究結(jié)果，用7種血清標志物以不同組合作篩查進行比較，對包括Freeβ-hC

4、G、PAPPA在內(nèi)的7種標記物進行了綜合分析，發(fā)現(xiàn)Freeβ-hCG與PAPPA的雙聯(lián)檢測在孕早期的檢出率最高，與孕中期的多聯(lián)檢測的檢出率相當(dāng)。之后隨著高分辨率超聲技術(shù)的發(fā)展，超聲在產(chǎn)前篩查及產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用越來越廣。Bianchi DW的研究發(fā)現(xiàn)孕早期Freeβ-hCG與PAPPA的二聯(lián)檢測血清篩查結(jié)合彩色多普勒超聲(NT)可達到86.3％的檢出率，是目前被認為最常用，最有效的妊娠早期聯(lián)合篩查方案，也是唐氏綜合征產(chǎn)前篩查的趨勢。

5、>　　 從目前國內(nèi)外各醫(yī)院產(chǎn)前篩查的檢測方法看，大部分是標記免疫分析技術(shù)，此技術(shù)具有靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于產(chǎn)前篩查各血清標志物的基礎(chǔ)和臨床各個領(lǐng)域的應(yīng)用研究。目前最常用的標記免疫分析技術(shù)是酶聯(lián)免疫分析（Enzymatic immunoassay，EIA）、化學(xué)發(fā)光免疫分析(Chemilinescent immunoassay， CLIA)和時間分辨熒光免疫分析(Time-resolved fluoroimmunoas

6、say，TRFIA)，但EIA、CLIA、TRFIA在應(yīng)用中存在著一些缺陷:EIA檢測為一種定性，至多為半定量檢測，EIA酶的活性容易受各種外在因素的影響而失活，導(dǎo)致EIA的靈敏度不高，酶的大分子標記容易影響被標記物的空間結(jié)構(gòu)，使得EIA靈敏度的提高受到限制;CLIA影響因素較多，易受環(huán)境干擾，發(fā)光時間短，化學(xué)反應(yīng)后樣品只可檢測一次，無法重復(fù)測量，并且為非開放性試劑，未國產(chǎn)化，試劑價格高;TRFIA是目前國內(nèi)外產(chǎn)前篩查的主要免疫分析技術(shù)

7、，但該技術(shù)測量方式復(fù)雜，反應(yīng)時間長，需通過洗滌分離結(jié)合標記與游離標記，儀器成本及維修費用高，環(huán)境及樣品中同位元素可導(dǎo)致本底干擾。近年來，由于新原理、新技術(shù)的不斷應(yīng)用，標記免疫技術(shù)得到了一定的發(fā)展。光激化學(xué)發(fā)光免疫分析(Amplified Luminescent Proximity Homogenous Assay，AlphaLISA)技術(shù)起源于1994年發(fā)明的單線態(tài)氧分子能量傳遞發(fā)光免疫分析技術(shù)(Luminescent Oxygen C

8、hanneling Immunoassay、LOCI)，后美國PerkinElmer公司生產(chǎn)相關(guān)試劑(AlphaScreen(R))，作為近年興起的新型定量均相免疫學(xué)檢測技術(shù)，采用了以聚苯乙烯膠乳為載體的納米微球，實現(xiàn)了均相免疫測定，使操作快速簡便，易實現(xiàn)自動化規(guī)?；瘷z測，此外還具有靈敏度高、線性范圍寬、穩(wěn)定性好及價格低廉的特點，已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究和臨床醫(yī)學(xué)檢驗，代表了現(xiàn)在及未來分析檢測技術(shù)的發(fā)展趨勢。
　　 本研究采用該

9、新型免疫分析技術(shù)，聯(lián)合利用雙抗體夾心法和生物素-鏈霉親和素放大系統(tǒng)，研制Freeβ-hCG與PAPPA定量檢測試劑，評價自制試劑的各項性能指標，并與同類進口試劑盒進行比較，評價其在臨床運用中的可行性。同時檢測了中國南方地區(qū)孕婦不同孕周時Freeβ-hCG與PAPPA的血清含量，確立了不同孕周的中位數(shù)水平，為正常值參考范圍的確定提供了一定的依據(jù)。
　　 方法:
　　 采用雙抗體夾心法研制游離β-促絨毛膜性腺激素、妊娠相關(guān)血

10、清蛋白光激化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑。
　　 1.參考標準品的制備:用標準品緩沖液將Freeβ-hCG抗原配制成0 ng/mL、3ng/mL、10 ng/mL、30 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL系列濃度，每瓶0.5 mL分裝凍干，4℃保存?zhèn)溆?用標準品緩沖液將PAPPA抗原配制成0 mU/L、10mU/L、40 mU/L、200 mU/L、800 mU/L、2000 mU/L系列濃度，每瓶0.5 mL分裝凍干，4

11、℃保存?zhèn)溆谩?br>　　 2.受體微球與抗體連接:在帶有濾膜的離心管中加入0.2 mg包被抗體，9000 rpm離心8 min，每次用緩沖液(0.13 mol/L，pH8.0 PBS)洗滌，重復(fù)6次后，在抗體溶液中加入1 mg受體微球、10μL25 mμ/mL NaBH3CN（用上述PBS緩沖液配制）、1.25μL10％Tween-20，最后用上述PBS緩沖液將體積補充到200μL，37℃振蕩孵育48 h。加入10μL65 mg/mL

12、 CMO（用0.8 M NaOH配制）封閉未結(jié)合位點，37℃振蕩孵育1h后離心洗滌，得到已連接抗體的受體微球，調(diào)整受體微球濃度為5 mg/mL。
　　 3.生物素與抗體連接:在帶有濾膜的離心管中加入另一株標記抗體1 mg，9000rpm離心8 min。用緩沖液（含0.1％ NaN3的0.1 mol/L，pH9.5 Na2CO3/NaHCO3）重復(fù)洗滌6次后，在50μ1抗體溶液中加入5μ122 mg/mL生物素（用DMSO配制），

13、室溫振動孵育4h。利用帶有濾膜的離心管去除多余的生物素，并將其抗體濃度調(diào)整為1 mg/mL。
　　 4.試劑性能指標的評價
　　 4.1.標準曲線的繪制:以自制試劑中參考標準品濃度的對數(shù)為橫坐標，信號值1×103計數(shù)的對數(shù)為縱坐標，由雙對數(shù)數(shù)學(xué)模型Log-Log函數(shù)處理。
　　 4.2.靈敏度實驗:將零參考標準品當(dāng)作樣品測量20次，計算其均值及標準差。以其測定值的均值加上2倍標準差所得信號值，代入標準曲線方程計算

14、所得出的濃度，即為其靈敏度。
　　 4.3.回收率實驗:取兩個已知濃度的血清樣本，用樣本稀釋液按照不同比例進行稀釋，根據(jù)測出的實際值和理論值的比值，算出相應(yīng)的回收率。
　　 4.4.精密度實驗:重復(fù)測定Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三個血清質(zhì)控品各10次，得到質(zhì)控品檢測值的均數(shù)、標準差及CV值。
　　 4.5.特異性實驗:將一定濃度的干擾物質(zhì)作為樣本進行檢測后得到的相應(yīng)濃度即為特異性。
　　 4.6.干擾性實驗:對加入了血紅

15、蛋白、甘油三酯和膽紅素的樣本進行測定，計算其回收率。
　　 4.7.正常值參考范圍:以自制試劑檢測健康孕婦血清，統(tǒng)計其血清濃度在孕早期不同孕周中的分布情況，為自制試劑的正常值參考范圍的建立提供一定的依據(jù)。
　　 4.8.與國外試劑的比較實驗:樣本用自制試劑與PerkinElmer TRFIA診斷試劑盒進行平行測試后，對所得濃度值進行配對非參數(shù)秩和檢驗和相關(guān)性分析。
　　 結(jié)果:
　　 本研究研制了產(chǎn)前篩查

16、孕早期血清中Freeβ-hCG與PAPPA的診斷試劑，并評價了試劑的各項性能指標:準確性及靈敏度、回收率、特異性、精密度、并與國外時間分辨Time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）診斷試劑盒進行比較，評價了其應(yīng)用于臨床檢測的可行性。研究結(jié)果顯示:
　　 (1) FreeβHCG-AlphaLISA檢測試劑在優(yōu)化條件下靈敏度為0.11 ng/ml、線性范圍為0.11-200 ng/ml;稀釋回收率

17、為98％-108％;試劑分析內(nèi)分析間變異系數(shù)為分析內(nèi)的CV為1.32％～4.50％，分析間CV為4.69％～4.95％;與LH(luteinizing hormone)、FSH(follicle stimulating hormone)、HCG和TSH(thyroid stimulating hormone)無明顯交叉反應(yīng)，特異性較好;4168份8-20周的健康孕婦血清用自制試劑進行檢測，建立了自制試劑在不同孕期的中位數(shù)水平，為正常值參

18、考范圍的確定提供了一定的依據(jù);188份臨床血樣用本試劑與PerkinElmer TRFIA診斷試劑盒進行同時檢測，配對非參數(shù)秩和檢驗結(jié)果如下:Z=-0.842，P=0.412＞0.05，表明兩試劑在檢測Freeβ-HCG濃度上無統(tǒng)計學(xué)差異;進行相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)(r)為0.989，相關(guān)方程為AlphaLISA=1.045 TRFIA+1.580，P＜0.001。
　　 (2) PAPPA-AlphaLISA檢測試劑分析靈敏度為

19、1.365 mU/L，線性范圍為1.365-10000 mU/L;試劑分析內(nèi)變異系數(shù)為5.61％-6.51％，分析間變異系數(shù)為2.07％-4.82％;與人甲胎蛋白、人泌乳素、人胎盤泌乳素、人絨毛膜促性腺激素等無交叉反應(yīng)，且不易受血清中干擾性物質(zhì)（溶血、高血脂、高膽紅素）的干擾，表示其特異性好;853份9-13周的正常孕婦血清用自制試劑進行檢測，建立了孕婦血清在不同孕周時的中位數(shù)水平，為正常值參考范圍的確定提供了一定依據(jù);165份臨床樣本

20、用自制試劑與PerkinElmer TRFIA診斷試劑盒進行平行檢測，配對非參數(shù)秩和檢驗結(jié)果如下:Z=-0.197，P=0.844＞0.05，表明兩試劑在檢測PAPPA濃度上無統(tǒng)計學(xué)差異;進行相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)(r)為0.987，相關(guān)方程AlphaLISA=0.976TRFIA+46.808，P＜0.001。
　　 結(jié)論:
　　 上述結(jié)果表明本研究研制的游離β-促絨毛膜性腺激素、妊娠相關(guān)血清蛋白光激化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑