產(chǎn)紫杉醇真菌NK-101關(guān)鍵基因的功能研究與營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的構(gòu)建.pdf

1、紫杉醇類化合物具有三環(huán)二萜的骨架結(jié)構(gòu)，最初是從紅豆杉等植物中分離獲得。研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇是一種高效、低毒、應(yīng)用廣譜、作用機(jī)制獨(dú)特的天然抗腫瘤藥物。但是由于受到原料來(lái)源和提取技術(shù)的制約，長(zhǎng)期以來(lái)紫杉醇類藥物在市場(chǎng)上處于供不應(yīng)求的狀態(tài)。近年來(lái)，應(yīng)用植物內(nèi)生真菌發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)紫杉醇的技術(shù)取得了一定進(jìn)展，為提高紫杉醇的產(chǎn)量開(kāi)辟了新的途徑，將會(huì)帶來(lái)巨大的市場(chǎng)前景和經(jīng)濟(jì)效益。
　　 近二十年來(lái)，擬盤(pán)多毛孢屬(Pestalotiopsis ge

2、nus)真菌由于能產(chǎn)生大量的具有生物活性的天然產(chǎn)物，越來(lái)越引起人們的關(guān)注。但是目前的許多研究報(bào)道還只停留在宏觀的水平，對(duì)其深入的分子層面的研究還很少。本實(shí)驗(yàn)室篩選到一株產(chǎn)紫杉醇的擬盤(pán)多毛孢屬真菌NK-101，經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)上的分析鑒定，認(rèn)為NK-101屬于Pestalotiopsis malicola。目前本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)對(duì)NK-101進(jìn)行de novo全基因組測(cè)序，首次獲得擬盤(pán)多毛孢屬真菌的基因組信息，為全面研究NK-101菌株中

3、關(guān)鍵基因功能奠定了基礎(chǔ)。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)氨基酸序列比對(duì)，得到了NK-101菌株中與加拿大紅豆杉（Taxuscanadensis）中苯丙氨酸氨基變位酶（phenylalanine aminomutase）(GenB ank:AAT47186.1)和美國(guó)短葉紅豆杉（Taxus brevifolia）中紫杉二烯合成酶(taxadienesynthase)(GenBank: U48796)同源性較高的基因，將其分別命名為PAM基因和T

4、S基因;通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的絲狀真菌轉(zhuǎn)化的方法，將敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)入NK-101菌株中并將PAM基因和TS基因定向敲除，獲得△pam和△ts菌株。通過(guò)對(duì)比野生型NK-101菌株和敲除菌株的菌落形態(tài)、產(chǎn)孢能力、菌絲生物量以及次級(jí)代謝產(chǎn)物合成能力等多種指標(biāo)，推測(cè)PAM基因和TS基因的功能并做進(jìn)一步的研究。
　　 同時(shí)，將NK-101菌株中URA-3基因和ADE基因進(jìn)行定向敲除，得到了尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株和腺嘌呤營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，為絲狀真菌的轉(zhuǎn)化