小鼠胚胎發(fā)育過程中內(nèi)皮和平滑肌標(biāo)志物的表達(dá)變化.pdf

1、血管增殖失調(diào)是臨床常見的病理過程，如動(dòng)脈粥樣硬化、同種異體移植后血管重塑、支架內(nèi)再狹窄、經(jīng)皮球囊血管成形術(shù)等，探討血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smOOth muscle eells，VSMCs)的起源有助于增生性血管病的治療。以往認(rèn)為胚胎的VSMCs起源于神經(jīng)嵴和胚胎中胚層；新近發(fā)現(xiàn)VSMCs還可能起源于成體骨髓干細(xì)胞或祖細(xì)胞、外周血的單核細(xì)胞、骨骼肌的成體干細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞(Endothelium eells，ECs)等。Yama

2、shita J等的體外研究證實(shí)，胚胎干細(xì)胞來源的胎肝激酶-1(Fetal liverkinase-1，F(xiàn)lk-1)，即血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2陽性細(xì)胞在血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)作用下可分化為血管ECs，在血小板源性生長(zhǎng)因子．BB作用下可分化為VSMCs，因此認(rèn)為Flk-1陽性細(xì)胞是血管ECs和VSMCs的共同前體，然而該理論尚缺乏在體證據(jù)支持。我們通過對(duì)胚胎血管行

3、Flk-1、血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子(Plateletendothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1/CD31)、Ⅷ因子相關(guān)抗原及平滑肌α-肌動(dòng)蛋白(Smooth Muscle α-actin，SM α-actin)免疫組織化學(xué)染色，探討上述標(biāo)志物在血管形成初期的表達(dá)時(shí)相及空間位置關(guān)系，為VSMCs的起源提供新的在體實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 Flk-1主要分布于ECs、造血細(xì)胞及其前體細(xì)胞，已有報(bào)道Fl

4、k-1最早出現(xiàn)于小鼠胚胎6.5 d，在ECs及造血細(xì)胞的發(fā)育中發(fā)揮重要作用；在血管新生生理過程或腫瘤等病理過程中也可觀察到Flk-1呈高表達(dá)，但小鼠植入前胚胎是否表達(dá)Flk-1迄今尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬初步探討Flk-1在小鼠植入前胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)規(guī)律及其在胚胎發(fā)育中的作用。 1.獲取8.5～18.5 d胚胎：將母鼠分別放入公鼠籠內(nèi)過夜、交配。次日清晨檢查到白色陰道栓者為懷孕鼠，該天記為懷孕第0.5d。在母鼠懷孕第8.5～18

5、.5d，處死母鼠，取出胚胎。 2.獲取植入前胚胎：母鼠腹腔內(nèi)注射孕馬激素10U，44～48h后注射人絨毛膜促性腺激素5U，隨后將其分別放入公鼠籠內(nèi)過夜、交配。12h獲取單細(xì)胞期胚胎，36h獲取2細(xì)胞期胚胎，48h獲取4細(xì)胞期胚胎，60h獲取8細(xì)胞期胚胎，84～96h獲取囊胚。從超排卵母鼠的輸卵管沖出單細(xì)胞期胚胎到8細(xì)胞期胚胎，從子宮中沖出桑椹胚和囊胚。 3.8.5～18.5 d胚胎標(biāo)本置4﹪多聚甲醛(Paraformal

6、dehyde，PFA)中室溫固定3h，按常規(guī)脫水后石蠟包埋，制備橫斷面5μm厚度連續(xù)切片，挑選胸腔部分和腹腔部分的主動(dòng)脈切片染色。 4.植入前胚胎經(jīng)3 g/L聚乙烯基吡咯烷酮/磷酸鹽緩沖液(Polyvinylpyrrolidone/phosphatebuffered saline，PVP/PBS)中洗滌，2.5﹪PFA室溫固定15 min，置PVP/PBS液4℃保存，待用。 5.8.5～18.5 d胚胎切片行蘇木素-伊紅

7、染色，觀察背主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)變化。 6.8.5～18.5 d胚胎切片行Flk-1、CD31、Ⅷ因子相關(guān)抗原及SM α-actin免疫組織化學(xué)染色，觀察胚胎發(fā)育過程中，背主動(dòng)脈ECs及VSMCs標(biāo)記物的表達(dá)變化。 7.收集植入前各期胚胎20個(gè)，采用mRNA Capture Kit試劑盒可捕獲總mRNA，行Flk-1的反轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈(Reverse transcription polymerasechain reactiON，

8、RT-PCR．)反應(yīng)，觀察Flk-1的表達(dá)變化規(guī)律。 8.植入前各期胚胎采用微滴操作行Flk-1全胚免疫熒光染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察Flk-1的表達(dá)及定位。 9.將8細(xì)胞期胚胎置于含5mg/L Flk-1中和抗體的胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)12h后，加入綠色熒光標(biāo)記的羊抗大鼠二抗，觀察透明帶是否能通過抗體等大分子物質(zhì)。 10. 取8細(xì)胞期胚胎隨機(jī)分3組，實(shí)驗(yàn)組加入Flk-1中和抗體5 mg/L至胚胎培養(yǎng)液中，空白對(duì)照

9、組為胚胎培養(yǎng)液，抗體對(duì)照組加入非中和抗體5mg/L，至胚胎培養(yǎng)液中，培養(yǎng)36h后計(jì)算囊胚形成率。采用X<'2>檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 11. 8細(xì)胞期胚胎采用微滴操作行VEGF全胚免疫熒光染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察VEGF的表達(dá)及定位。 1．胚胎8.5 d在胸腔部分和腹腔部分均可見左、右背主動(dòng)脈，9.5 d腹腔部分可見單一背主動(dòng)脈，而胸腔部分心臟水平仍然維持左、右背主動(dòng)脈的形態(tài)；8.5～9

10、.5 d背主動(dòng)脈呈現(xiàn)Flk-1陽性、CD31陽性、Ⅷ因子相關(guān)抗原陰性、SM α-actin陰性。 2．胚胎10.5 d左、右背主動(dòng)脈在腹腔部分和胸腔下部為一條背主動(dòng)脈，但仍為單層細(xì)胞圍成的管腔，而在心房水平仍然可見左、右背主動(dòng)脈，且呈現(xiàn)SM α-actin、Flk-1、CD31、Ⅷ因子相關(guān)抗原均陽性。 3．胚胎11.5 d背主動(dòng)脈管壁發(fā)育為多層，內(nèi)層細(xì)胞呈Flk-1陽性、SMα-actin陰性，外層細(xì)胞呈Flk-1陰性而

11、SM α-actin陽性，血管與周圍間充質(zhì)無明顯分界，背主動(dòng)脈管壁周圍可見散在SM α-actin陽性細(xì)胞。 4．胚胎11.5 d之后，背主動(dòng)脈管壁VSMCs數(shù)量增多且由不規(guī)則型轉(zhuǎn)變?yōu)榧忓N型，內(nèi)層ECs繼續(xù)呈Flk-1陽性、SM α-actin陰性，外層VSMCsFlk-1陰性、SM α-actin陽性，血管與周圍間充質(zhì)分界清楚，背主動(dòng)脈血管周圍無散在SM α-actin陽性細(xì)胞。 5．在植入前小鼠胚胎中8細(xì)胞期胚胎Fl

12、k-1表達(dá)最高，在RT-PCR反應(yīng)28個(gè)循環(huán)時(shí)只有8細(xì)胞期胚胎可檢測(cè)到Flk-1；循環(huán)數(shù)增加到32個(gè)時(shí)4細(xì)胞期胚胎也檢測(cè)到Flk-1表達(dá)。在單細(xì)胞期、2細(xì)胞期、桑椹胚期和囊胚期胚胎均未檢測(cè)到F1k-1表達(dá)。 6．4細(xì)胞期胚胎的細(xì)胞膜上可見綠色熒光，主要定位于胚胎的外緣和細(xì)胞交界處，胞漿和胞核均未見綠色熒光；8細(xì)胞期胚胎細(xì)胞表面的綠色熒光較4細(xì)胞期胚胎增強(qiáng)，蛋白定位同4細(xì)胞期胚胎。單細(xì)胞期、2細(xì)胞期、桑椹胚期、囊胚期表達(dá)呈陰性。

13、 7．取8細(xì)胞期胚胎在含F(xiàn)lk-1中和抗體5 mg/L的胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)12h后加入二抗，發(fā)現(xiàn)綠色熒光出現(xiàn)在胚胎的透明帶內(nèi)部，說明透明帶可通過抗體等大分子物質(zhì)。 8．取8細(xì)胞期胚胎在含F(xiàn)lk-1中和抗體5 mg/L的胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)，各組36 h囊胚形成率如下：空白對(duì)照組80.95﹪(17/21)，抗體對(duì)照組81.81﹪(18/22)，實(shí)驗(yàn)組40.00﹪(10/25)。空白對(duì)照組和抗體對(duì)照組36 h囊胚形成率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。