金屬蛋白酶ADAMTS在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和軟骨發(fā)育中的作用.pdf

1、一、ADAMTS-7在小鼠炎性關(guān)節(jié)炎中的作用及分子機(jī)制
　　類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是一種慢性全身性炎性疾病，以多部位關(guān)節(jié)炎癥和關(guān)節(jié)軟骨及骨的破壞為主要特征。RA發(fā)病率約占世界成年人群的0.5-1％，其中以女性患者居多。RA的具體病因尚不清楚，研究發(fā)現(xiàn)，RA患者滑膜組織產(chǎn)生的蛋白酶和細(xì)胞因子在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨和骨組織的破壞過(guò)程中具有重要作用。人類(lèi)含Ⅰ型血小板結(jié)合蛋白基序（TSP）的解聚蛋白樣金屬蛋白酶（ADAMTS）家族由19

2、個(gè)分泌型多結(jié)構(gòu)域鋅指金屬蛋白酶組成，這些 ADAMTS金屬蛋白酶能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)成分（ ECM），包括原膠原、蛋白聚糖和軟骨寡聚基質(zhì)蛋白（COMP）。ADAMTS蛋白酶家族成員根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的差異可以分為四類(lèi)：蛋白聚糖蛋白酶、原膠原蛋白酶、血漿血管性血友病因子降解酶（ADAMTS-13）和其他ADAMTS蛋白酶（包括ADAMTS-6、-7、-10、-12、-16和-19）。ADAMTS蛋白酶在各種組織細(xì)胞外基質(zhì)成分翻轉(zhuǎn)中具有重要作用，

3、這些酶的異常表達(dá)通常和炎性病理過(guò)程密切相關(guān)，例如腫瘤、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和動(dòng)脈粥樣硬化。ADAMTS-7與ADAMTS-12結(jié)構(gòu)類(lèi)似屬于同一亞群，ADAMTS-7在骨、軟骨、滑膜、肌腱和韌帶組織中均有表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)，ADAMTS-7蛋白酶不能降解蛋白聚糖，但可以直接結(jié)合和降解COMP蛋白，其C端含有4個(gè)結(jié)合COMP所必需的 TSP基序。在生理學(xué)條件下， ADAMTS-7作為甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白（PTHrP）信號(hào)的下游分子，抑制軟骨細(xì)胞分化和

4、軟骨內(nèi)骨形成。在RA患者和骨關(guān)節(jié)炎（OA）患者的滑膜組織中檢測(cè)到ADAMTS-7的表達(dá)增加。在手術(shù)誘導(dǎo)的OA模型中，ADAMTS-7基因過(guò)表達(dá)促進(jìn)OA的發(fā)生發(fā)展，但在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中ADAMTS-7的作用目前尚不清楚。
　　為研究 ADAMTS-7在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的作用，用膠原蛋白誘導(dǎo) DBA/1J小鼠建立了類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型，免疫組化法檢測(cè)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展過(guò)程中 ADAMTS-7的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠關(guān)節(jié)軟骨中 AD

5、AMTS-7的表達(dá)水平隨炎癥程度的加深而升高，說(shuō)明ADAMTS-7蛋白酶參與了小鼠炎類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展。
　　為確定 ADAMTS-7對(duì)小鼠類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)生和嚴(yán)重性的影響，利用ADAMTS-7轉(zhuǎn)基因小鼠建立了小鼠類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ADAMTS-7轉(zhuǎn)基因小鼠在誘導(dǎo)后4周即出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎癥狀，而野生型在誘導(dǎo)后5周才開(kāi)始出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎癥狀。在誘導(dǎo)后第10周，ADAMTS-7轉(zhuǎn)基因小鼠CIA發(fā)病率為89%，而對(duì)照組野生型小鼠C

6、IA發(fā)病率僅為33%。膠原誘導(dǎo)的ADAMTS-7轉(zhuǎn)基因小鼠肉眼觀察到包括前后爪的腕關(guān)節(jié)和踝關(guān)節(jié)可見(jiàn)明顯腫脹充血，而野生型小鼠觀測(cè)到輕微的炎癥反應(yīng)。X射線顯影和 micro-CT檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)膠原誘導(dǎo)的ADAMTS-7轉(zhuǎn)基因小鼠骨侵蝕和骨破壞程度明顯高于野生型小鼠。膠原誘導(dǎo)的ADAMTS-7轉(zhuǎn)基因小鼠的臨床關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重性是否與組織病理學(xué)變化相一致，分別對(duì)ADAMTS-7轉(zhuǎn)基因和野生型小鼠的關(guān)節(jié)進(jìn)行了組織病理學(xué)檢查。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膠原誘導(dǎo)的ADAM

7、TS-7轉(zhuǎn)基因小鼠滑膜炎、血管翳和骨侵蝕的評(píng)分明顯增加，Safranin-O染色出現(xiàn)軟骨基質(zhì)大量丟失，TRAP染色中破骨細(xì)胞陽(yáng)性染色增多。這些結(jié)果說(shuō)明，ADAMTS-7基因過(guò)表達(dá)促進(jìn)了小鼠類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和嚴(yán)重性。
　　金屬蛋白酶的異常表達(dá)和細(xì)胞外基質(zhì)成分的降解在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病中具有非常重要的作用。ADAMTS-7轉(zhuǎn)基因小鼠類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度是否與基質(zhì)蛋白的降解和其他蛋白酶的異常表達(dá)有關(guān)，采用real-time PC

8、R、ELISA和免疫組化法檢測(cè)了這些蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果表明，在膠原誘導(dǎo)的類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型中， ADAMTS-7基因過(guò)表達(dá)上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-13的表達(dá)水平，加速了關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)蛋白成分COMP和aggrecan的降解，從而促進(jìn)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展。
　　膠原誘導(dǎo)的ADAMTS-7轉(zhuǎn)基因小鼠關(guān)節(jié)炎敏感性和嚴(yán)重性增強(qiáng)是否與某些炎性細(xì)胞因子的過(guò)量產(chǎn)生相關(guān)，為此，采用real-time PCR、ELISA和流式細(xì)胞分析（F

9、ACS）檢測(cè)了膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎中重要細(xì)胞因子TNF-α和IL-17，結(jié)果表明， ADAMTS-7過(guò)表達(dá)促進(jìn)了類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎小鼠的血清和淋巴結(jié)細(xì)胞中TNF-α和IL-17的表達(dá)。為更深入研究ADAMTS-7在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中發(fā)病機(jī)制的作用，將ADAMTS-7表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞Raw264.7，Western blotting檢測(cè)ADAMTS-7過(guò)表達(dá)對(duì)TNF-α介導(dǎo)的信號(hào)通路NF-κB和p38 MAPK的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ADAMTS-7

10、過(guò)表達(dá)促進(jìn)TNF-α誘導(dǎo)的IκB的磷酸化和降解，同時(shí)也可以促進(jìn)p38激酶的激活。
　　綜上所述，在小鼠類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展過(guò)程中ADAMTS-7被誘導(dǎo)表達(dá)， ADAMTS-7過(guò)表達(dá)促進(jìn)了小鼠類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病起始和嚴(yán)重性。膠原誘導(dǎo)的ADAMTS-7轉(zhuǎn)基因小鼠臨床和組織病理學(xué)評(píng)分明顯高于野生型小鼠；在膠原蛋白誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎模型中，ADAMTS-7轉(zhuǎn)基因小鼠關(guān)節(jié)軟骨和骨組織破壞嚴(yán)重與TNF-α和IL-17的過(guò)量產(chǎn)生有關(guān)；ADAM

11、TS-7基因過(guò)表達(dá)能夠增強(qiáng)TNF-α介導(dǎo)的NF-κB激活和p38 MAPK激酶磷酸化?？傊?，研究表明ADAMTS-7在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要作用，可能會(huì)成為預(yù)防和治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的分子靶標(biāo)。
　　二、ADAMTS-18在軟骨及骨發(fā)育中的作用
　　ADAMTS家族由19個(gè)分泌型多結(jié)構(gòu)域鋅指金屬蛋白酶組成，在多種生理和病理過(guò)程中都具有重要作用，如骨發(fā)育和關(guān)節(jié)炎。ADAMTS-18蛋白酶屬于ADAMTS蛋白酶家族

12、第四亞類(lèi)成員，與ADAMTS-16的結(jié)構(gòu)相似。在體外， ADAMTS-18具有降解聚蛋白聚糖的酶活性，但是酶活性相對(duì)較低，需要高濃度的ADAMTS-18存在。目前，ADAMTS-18在軟骨和骨發(fā)育中的作用尚不清楚，至今未見(jiàn)報(bào)道。為確定ADAMTS-18在軟骨和骨發(fā)育中的作用，我們通過(guò)免疫組化法檢測(cè)了ADAMTS-18在骨發(fā)育過(guò)程中不同時(shí)間和空間的表達(dá)特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ADAMTS-18主要在肥大軟骨細(xì)胞中表達(dá)。出生后2周的ADAMTS-1

13、8基因缺失小鼠開(kāi)始出現(xiàn)生長(zhǎng)遲緩，體型明顯較小，直至成年鼠。對(duì)4周齡小鼠關(guān)節(jié)軟骨生長(zhǎng)板的Safranin-O染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ADAMTS-18基因缺失影響生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)，ADAMTS-18基因缺失小鼠生長(zhǎng)板變薄，軟骨細(xì)胞層數(shù)減少，尤其是肥大軟骨細(xì)胞區(qū)長(zhǎng)度明顯變短。micro-CT結(jié)果發(fā)現(xiàn)ADAMTS-18基因缺失降低了骨小梁的數(shù)目和厚度及增大了骨小梁之間的空間。采用real-time PCR檢測(cè)ADAMTS-18基因缺失小鼠和野生型小鼠

14、軟骨發(fā)育中相關(guān)基因的表達(dá)差異，分析ADAMTS-18在軟骨發(fā)育中可能的分子機(jī)制，結(jié)果表明，ADAMTS-18基因缺失小鼠軟骨中ColⅡ、CoIX、MMP13、Sox5和Runx2的mRNA的表達(dá)水平與野生型小鼠相比具有顯著差異。
　　綜上所述，ADAMTS-18主要在小鼠的肥大軟骨細(xì)胞中表達(dá)；ADAMTS-18基因缺失小鼠在出生后2周開(kāi)始出現(xiàn)生長(zhǎng)遲緩，體型明顯較小，可能與軟骨內(nèi)成骨障礙相關(guān)；ADAMTS-18影響軟骨細(xì)胞向肥大軟骨