GPR30調(diào)控子宮內(nèi)膜癌IL-6-STAT3機(jī)制的研究.pdf

1、子宮內(nèi)膜癌是女性生殖道最常見的惡性腫瘤之一，雌激素是其重要的致癌因子。但迄今為止，子宮內(nèi)膜癌發(fā)生進(jìn)展機(jī)制仍知之甚少。GPR30是一種新型雌激素跨膜受體，發(fā)揮雌激素的非基因組效應(yīng)，其參與子宮內(nèi)膜癌的惡性生物學(xué)行為的調(diào)控。課題組前期研究證實(shí)，雌激素與GPR30結(jié)合后，促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的增殖、侵襲和腫瘤形成，并且促進(jìn)炎性因子IL-6的分泌,提示GPR30通過調(diào)控IL-6炎癥信號(hào)通路而非經(jīng)由ERα的途徑促進(jìn)內(nèi)膜癌的播散和轉(zhuǎn)移[1，2]。炎癥微環(huán)境

2、是腫瘤的重要特征，炎性因子IL-6激活其下游的轉(zhuǎn)錄因子STAT3，誘導(dǎo)和維持腫瘤的炎癥微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究表明，子宮內(nèi)膜癌患者血清中IL-6均處于高水平，提示炎性因子IL-6參與子宮內(nèi)膜癌的調(diào)控，子宮內(nèi)膜癌與IL-6密切相關(guān)，而且雌激素又能激活STAT3。為此本研究的目的是探討新型雌激素跨膜受體GPR30對(duì)子宮內(nèi)膜癌中 IL-6/STAT3炎癥信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用。因此本研究檢測(cè)了子宮內(nèi)膜癌組織中GPR30、IL-6/STAT

3、3在的表達(dá)情況，GPR30干擾前后的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系 Ishikawa(ER+)，KLE(ER-)中IL-6/STAT3蛋白表達(dá)，以及細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6的含量，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染下調(diào)GPR30后子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖侵襲能力，以揭示GPR30對(duì)IL-6/STAT3調(diào)控及該調(diào)控通路在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的作用及可能的機(jī)制。
　　目的：探討新型雌激素跨膜受體GPR30對(duì)子宮內(nèi)膜癌中IL-6/STAT3炎癥信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用。
　　方法：

4、r>　　1.實(shí)驗(yàn)對(duì)象：
　　1.1組織標(biāo)本：隨機(jī)選取2004年5月至2012年7月在上海市第一人民醫(yī)院婦科收治的子宮內(nèi)膜癌病人的手術(shù)切除標(biāo)本30例。入選標(biāo)準(zhǔn)：患者年齡為37-73歲，手術(shù)前未行放化療或激素類藥物治療，并按國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期。該研究獲得上海市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，對(duì)患者履行知情同意手續(xù)。
　　1.2細(xì)胞株：本研究選用人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系Ishikawa和KLE由上海市第一人民醫(yī)院

5、婦產(chǎn)科豐有吉教授課題組保存，其中Ishikawa細(xì)胞為雌激素核受體（ER）表達(dá)陽性的細(xì)胞株，而KLE細(xì)胞是雌激素核受體（ER）表達(dá)陰性的細(xì)胞株。
　　2.采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌組織中GPR30,STAT3,IL-6R的表達(dá)情況。
　　3.實(shí)驗(yàn)分組：將子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系Ishikawa(ER+)和KLE(ER-)分為5組：①Con組：陰性對(duì)照組；②E2組：以10-8M工作濃度的雌激素處理的細(xì)胞組；③G1組:以10-

6、8M工作濃度的G1（GPR30特異性激動(dòng)劑）處理的細(xì)胞組；④E2+G15組：以10-8M工作濃度的G15（GPR30特異性抑制劑）處理的E2組；⑤G1+G15組：以10-8M工作濃度的G15處理的G1組。
　　4.采用Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞中STAT3和IL-6R蛋白表達(dá)情況。
　　5.采用ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中IL-6的分泌情況。
　　6.構(gòu)建GPR30沉默表達(dá)的重組質(zhì)粒，并分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至K

7、LE和Ishikawa細(xì)胞系,應(yīng)用Western-blot方法檢測(cè)GPR30蛋白的表達(dá)情況。
　　7.實(shí)驗(yàn)分組：分別給予10-8M雌激素和10-8M G1處理，分為6組：①Con組：轉(zhuǎn)染空載體的陰性對(duì)照組；②RNAi組：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 GPR30沉默表達(dá)的細(xì)胞；③E2+Con組：以E2處理的Con組④E2+RNAi組：以E2處理的RNAi組⑤G1+Con組：以G1處理的Con組⑥G1+RNAi組：以G1處理的RNAi組
　　8.采

8、用Western blot法測(cè)定細(xì)胞中STAT3及IL-6R蛋白表達(dá)。
　　9.采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6的含量。
　　10.采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖情況。
　　11.采用Transwell法檢測(cè)各組細(xì)胞的侵襲能力。
　　結(jié)果：1. GPR30、STAT3、IL-6R均表達(dá)于子宮內(nèi)膜癌組織。
　　2. E2和G1顯著上調(diào)了Ishikawa和KLE細(xì)胞中STAT3以及IL-6R蛋白表達(dá)水

9、平(P<0.05)，與對(duì)照組相比明顯上升；聯(lián)合應(yīng)用G15后，STAT3和IL-6R蛋白表達(dá)的上調(diào)被阻斷(P<0.05)；
　　3.給予 E2和 G1作用后，Ishikawa和 KLE細(xì)胞中的 IL-6的分泌明顯增高（P<0.05）,而在分別聯(lián)合G15作用后，IL-6的分泌受到抑制(P<0.05)。
　　4.通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染下調(diào)GPR30基因后，細(xì)胞中的GPR30蛋白表達(dá)水平較轉(zhuǎn)染了無效質(zhì)粒的細(xì)胞明顯下降(P<0.05)；

10、　　5. GPR30穩(wěn)定下調(diào)后，E2和G1對(duì)STAT3以及IL-6R蛋白表達(dá)的上調(diào)被阻斷(P<0.05)。
　　6. GPR30穩(wěn)定下調(diào)后，E2和G1對(duì)IL-6分泌的促進(jìn)亦被抑制(P<0.05)。
　　7. GPR30穩(wěn)定下調(diào)減弱了細(xì)胞的增殖能力，抑制了E2和G1對(duì)細(xì)胞的增殖能力的促進(jìn)。
　　8. GPR30穩(wěn)定下調(diào)減弱了細(xì)胞的侵襲能力，抑制了E2和G1對(duì)細(xì)胞的侵襲能力的促進(jìn)。
　　結(jié)論：IL-6/STAT3炎癥