小夾板彈性固定對(duì)骨折愈合過(guò)程的促進(jìn)作用及其機(jī)理研究.pdf

1、本課題在國(guó)內(nèi)外首次將傳統(tǒng)的中國(guó)骨傷接骨術(shù)及小夾板固定技術(shù)用于實(shí)驗(yàn)性骨折中；采用先進(jìn)檢驗(yàn)指標(biāo)評(píng)估骨折愈合質(zhì)量，監(jiān)測(cè)骨折愈合過(guò)程，及其有利于或促進(jìn)骨折愈合的機(jī)理；將應(yīng)變式壓力傳感器用于骨折外固定器中，較為準(zhǔn)確地測(cè)出骨折端的微動(dòng)幅度，為設(shè)計(jì)新的骨折外固定器提供了思路；得出的研究結(jié)果，將為傳統(tǒng)的小夾板固定技術(shù)由經(jīng)驗(yàn)型轉(zhuǎn)變?yōu)榭茖W(xué)型提供實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)． 研究目的：本研究以實(shí)驗(yàn)性兔脛骨骨折動(dòng)物模型為研究對(duì)象，分別采用小夾板固定和鋼板固定，小夾

2、板固定中，通過(guò)調(diào)節(jié)小夾板扎帶的松緊度使骨折斷端承受不同的壓力，觀察骨折斷端在二種不同的壓力作用下對(duì)骨折愈合的影響，并與鋼板固定組相比較，主要觀察下列指標(biāo)： 研究方法： 實(shí)驗(yàn)一： 1、實(shí)驗(yàn)材料： 1.1 動(dòng)物：兔45只，體重2-2.5kg．由湖北省科學(xué)研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。 1.2試劑： SP-9001 SP檢驗(yàn)試劑盒SP-9002sP檢驗(yàn)試劑盒由北京中杉試劑公司提供抗VEGF抗TGF-β

3、1均由北京中杉試劑公司提供1.3儀器光學(xué)顯微鏡免疫組化儀器數(shù)件夾板：自制小夾板，由較好彈性杉樹(shù)皮制作。分前、后、內(nèi)、外側(cè)四塊夾板，夾板上寬下窄．前側(cè)夾板長(zhǎng)11cm，上端寬約2.4cm；后側(cè)夾板長(zhǎng)10cm，上端寬約2.4cm；內(nèi)、外側(cè)夾板長(zhǎng)均為10 cm，上端寬均為1.9cm．在前側(cè)、后側(cè)夾板靠近脛骨結(jié)節(jié)部各刺—1.5mm小孔。 鋼板：江蘇金鹿集團(tuán)醫(yī)療有線公司提供壓力傳感器：由武漢超字測(cè)控技術(shù)公司提供.構(gòu)造如下圖所示. 壓

4、力傳感器主要有壓力盒、導(dǎo)氣管、三通、注氣管，敏感元件以及半導(dǎo)體應(yīng)變片等組成。其原理為：在壓力測(cè)量之前，利用注氣管將氣體注入，使得氣管內(nèi)部充滿氣體，即使壓力傳感器的敏感元件兩側(cè)壓力平衡，敏感元件不受應(yīng)力作用．當(dāng)壓力盒受壓力作用時(shí)，導(dǎo)氣管內(nèi)的氣體受壓使得敏感元件變形而產(chǎn)生應(yīng)變，粘貼在敏感元件上的半導(dǎo)體應(yīng)變片將壓力變化產(chǎn)生的應(yīng)變轉(zhuǎn)換為電阻的變化，即建立了電阻變化與壓力之間的定量關(guān)系。使用全差動(dòng)測(cè)量電橋檢測(cè)電阻變化，即可得出壓力的變化關(guān)系．使用

5、時(shí)，將壓力傳感器包入夾板內(nèi)，通過(guò)傳感器數(shù)值，確定夾板系帶松緊程度． 2.實(shí)驗(yàn)方法： 2.1動(dòng)物造模與分組：選用45只健康家兔，在左脛骨中下三分之一處，復(fù)制3mm標(biāo)準(zhǔn)橫形骨折模型，隨機(jī)分成A組、B組和C組，A組和B組用石膏固定，C組用四孔鋼板內(nèi)固定，五天后小心撤除A組和B組石膏，改用小夾板局部外固定。在兔脛骨結(jié)節(jié)處橫穿一枚直經(jīng)為1.5mm克氏針，再穿入前后側(cè)夾板的眼內(nèi)，以防夾板滑脫，壓力傳感器置于前側(cè)夾板內(nèi)面骨折的斷端，再

6、用四條扎帶捆住四塊夾板，夾板上扎帶的松緊度不同，A、B組扎帶上下移動(dòng)分別約為3mm和7mm。此時(shí)讀出A組壓力傳感器讀數(shù)是18kPa，B組壓力傳感器讀數(shù)是12kPa． 2.2標(biāo)本的采集與處理：分別于術(shù)后14天，24天，34天處死A、B、C組每組各五只兔子，取脛骨骨折部上下方各1cm的骨干，10％福爾馬林固定三天后，經(jīng)5％硝酸脫鈣，流水沖洗，酒精梯度脫水，浸臘包埋，縱向切片厚度4 μm．切片經(jīng)二甲苯脫臘，梯度酒精水化，3％H2O2去

7、離子水孵育5分鐘滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶．蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘，微波修復(fù)．滴加山羊血清封閉后，按1：100稀釋的兔抗TGF-β1抗體和鼠抗VEGF抗體，4℃過(guò)夜。PBS沖洗3分鐘，沖洗3次，滴加生物素化二抗室溫孵育15分鐘。PBS沖洗3分鐘，沖洗3次，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，室溫孵育15分鐘，PBS沖洗3分鐘沖洗3次，用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染。梯度酒精脫水，透明后封片． 2.3觀察指標(biāo)：血管內(nèi)皮

8、生長(zhǎng)因子(VEGF)、生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化因子β1(TGF-β1)的表達(dá); 實(shí)驗(yàn)二： 1、實(shí)驗(yàn)材料： 1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：同實(shí)驗(yàn)一1.2儀器光鏡透射電鏡：H-500(日立)由廣州軍區(qū)武漢陸軍總醫(yī)院提供超薄切片機(jī)：由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供，瑞典LKB—II型2.實(shí)驗(yàn)方法2.1動(dòng)物模型制作與分組同實(shí)驗(yàn)一2.2觀察指標(biāo)及方法2.2.1大體觀察兔子處死后觀察外骨痂，內(nèi)骨痂，橋梁骨痂。 2.2.2組織形態(tài)觀察：用耳緣靜脈空氣栓塞法處死

9、兔子，于術(shù)后14天處死第一批兔子，24天處死第二批，34天處死第三批，每次每組5只．將脛骨標(biāo)本于骨折部上下方各1cm處鋸斷，10％福爾馬林固定備用，5％硝酸溶液脫鈣，流水沖洗，梯度酒精脫水，石臘包埋，縱向切片，片厚4um，常規(guī)HE染色，再用光學(xué)顯微鏡觀察． 2.2.3超微結(jié)構(gòu)觀察：前述方法和時(shí)間處死兔子后，立即取1mm3大小的標(biāo)本，用2.5％戊二醛固定。1％EDTA溶液脫鈣，緩沖液(PH7.2-7.4)沖洗三遍，再用1％餓酸后固

10、定2h，緩沖液沖洗，酒精梯度脫水，環(huán)氧樹(shù)脂812包埋，超薄切片，鉛鈾染色，透射電鏡觀察。 實(shí)驗(yàn)三： 1、材料與方法： 1.1 選用18只健康家兔，隨機(jī)分成A組、B組、c組，動(dòng)物造模和分組治療同實(shí)驗(yàn)一1.2檢測(cè)項(xiàng)目1.2.1 血清堿性磷酸酶指標(biāo)：分別于術(shù)前及術(shù)后第2、4、6周每組取6只兔用9號(hào)針頭經(jīng)心臟采血2ml/kg，進(jìn)行血清堿性磷酸酶(ALP)檢測(cè)(由湖北中醫(yī)院測(cè)定)． 1.2.2生物力學(xué)測(cè)試抗拉強(qiáng)度試

11、驗(yàn)：三組動(dòng)物在第六周時(shí)均采用耳緣靜脈空氣栓塞處死，解剖出左側(cè)脛骨，清除軟組織，紗布包裹，生理鹽水浸透。將試驗(yàn)用骨在20±5℃的環(huán)境溫度下放置不少于3h，，12小時(shí)內(nèi)測(cè)量。然后用鋼絲一端和兔脛骨固定，一端掛在LJ—500拉力機(jī)的夾具上，使用25mm/min拉伸速度進(jìn)行拉伸試驗(yàn)，直至脛骨拉斷，得到拉斷力數(shù)據(jù)，拉斷面應(yīng)在骨折愈合處附近，如果拉斷面在其他部位，則此樣品試驗(yàn)數(shù)據(jù)棄除．每個(gè)固定方式得到六個(gè)有效拉斷力數(shù)據(jù)，按骨外沿面積計(jì)算出骨的斷面積

12、，用拉斷力除以斷面積得到抗拉強(qiáng)度值，將六個(gè)抗拉強(qiáng)度數(shù)據(jù)按從大到小排序，第三和第四個(gè)數(shù)據(jù)的平均值為本固定方式的抗拉強(qiáng)度試驗(yàn)值，以MPa表示． 2、對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 實(shí)驗(yàn)四： 1、實(shí)驗(yàn)材料： 1.1 動(dòng)物兔18只，體重2-2.5kg。由湖北省科學(xué)研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供． 1.2儀器QDR 2000plus型DEXA2實(shí)驗(yàn)方法。 2.1動(dòng)物造模與分組：選用18只健康家兔，隨機(jī)分成A組、B

13、組、C組，動(dòng)物造模和分組治療同實(shí)驗(yàn)一，第6周末處死動(dòng)物，拆除內(nèi)外固定，解脫雙后肢膝關(guān)節(jié)，剔除全部軟組織，取雙側(cè)脛骨，保留骨膜． 2.2觀察指標(biāo)： 2.2.1 X線攝片觀察： 每只動(dòng)物在處死前先行X線攝片檢查，以確定沒(méi)有假關(guān)節(jié)形成．并觀察骨痂生長(zhǎng)和骨折愈合情況． 2.2.2骨密度測(cè)定： 采用QDR 2000plus型DEXA，以雙能X線吸收法，對(duì)脛骨中段骨折區(qū)作骨密度(BMD)測(cè)定，均在骨折部位取一

14、同等條件興趣區(qū)R1，以骨折為中心由近至遠(yuǎn)掃描10厘米長(zhǎng)距離．使用分析軟件分析測(cè)定的數(shù)據(jù)來(lái)計(jì)算骨折端1cm感興趣區(qū)域(Regions of Interest，ROIs)的BMD．同一動(dòng)物的未手術(shù)側(cè)標(biāo)本在骨折對(duì)應(yīng)部位掃描測(cè)量，作為自體對(duì)照數(shù)據(jù)。每一標(biāo)本重復(fù)測(cè)定三次，每次測(cè)量后標(biāo)本重置。DEXA由微機(jī)自動(dòng)分析打印結(jié)果。計(jì)算每對(duì)標(biāo)本的骨密度比率． 3、數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：參數(shù)比率的計(jì)算公式為：骨密度比率=對(duì)應(yīng)未手術(shù)側(cè)標(biāo)本的測(cè)量值／手術(shù)

15、側(cè)標(biāo)本的測(cè)量值×100％。各組骨密度的參數(shù)值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示． 研究結(jié)果： 1.免疫組化結(jié)果：在骨折愈合的各個(gè)階段，各組中TGF-β1在細(xì)胞中的表達(dá)增加，VEGF在細(xì)胞中的表達(dá)亦增加，二者存在著一定的協(xié)調(diào)關(guān)系．在骨折愈合的早期及中期，血管形成的量及時(shí)間A組早于B組和C組，骨痂形成的量亦高于B組和C組，因此陽(yáng)性表達(dá)較B組及C組早，陽(yáng)性程度明顯優(yōu)于B組和C組。 2.大體觀察： A組：14天骨折段已

16、初步聯(lián)接，見(jiàn)少量的梭形外骨痂，24天時(shí)，骨痂外形呈梭形，骨痂將兩骨折段橋接，34天，已由骨痂將骨折段牢固聯(lián)接在一起，骨折端無(wú)活動(dòng)度。B組：在14天時(shí)，處死的5只兔子有1只骨折端有錯(cuò)位；24天時(shí)，骨折端有部分聯(lián)接，但活動(dòng)度較大，外骨痂較A組少，34天時(shí)可見(jiàn)骨痂中等，呈梭形。骨折端未完全由骨痂聯(lián)接，骨折線仍清晰可見(jiàn)。C組：各時(shí)間段骨折端均無(wú)錯(cuò)位情況，14天時(shí)見(jiàn)纖維連接，24天時(shí)見(jiàn)中等量的散在的外骨痂，排列不整齊，未成梭形連接兩骨折端，34天

17、時(shí)，外骨痂部分成梭形連接兩骨折端，但連接的不牢固． 3.電鏡觀察顯示A組在骨折愈合過(guò)程中，成骨細(xì)胞出現(xiàn)早，數(shù)量較B組和C組均多，且功能活躍，34天時(shí)骨折端見(jiàn)大量功能活躍的骨細(xì)胞。 4.組織學(xué)檢測(cè)顯示，A組骨外膜骨痂，橋梁骨痂能早期加速形成，并逐漸形成連接骨痂，封閉骨痂，骨小梁堅(jiān)韌，34天時(shí)骨痂已連接骨端，骨折端進(jìn)行編織骨向板層骨轉(zhuǎn)化，明顯優(yōu)于B組和C組. 5.血清堿性磷酸酶結(jié)果：各組不同時(shí)期家兔血清AKP的變化幅