2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、近年來的研究發(fā)現(xiàn)成體干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)及創(chuàng)傷修復(fù)中具有重要作用,并已顯示出良好的治療前景。目前對口腔粘膜上皮干細(xì)胞的研究已經(jīng)開展,但對其生物學(xué)特性研究尚缺乏系統(tǒng)的認(rèn)識;而對口腔粘膜固有層細(xì)胞的研究比較少見,尤其是口腔粘膜固有層干細(xì)胞的研究更是未見相關(guān)報道?;诳谇徽衬づc皮膚類似,在維持正常組織結(jié)構(gòu)和機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起重要作用,以及皮膚源性上皮干細(xì)胞和真皮組織干細(xì)胞的研究進(jìn)展,因而在口腔粘膜中也應(yīng)含有類似的成體干細(xì)胞。 現(xiàn)代創(chuàng)傷修復(fù)

2、理論認(rèn)為在創(chuàng)傷愈合的過程中,不同的細(xì)胞成分被微環(huán)境激活,參與組織修復(fù)。而且體內(nèi)局部組織特異性的微環(huán)境也決定了干細(xì)胞的可塑性。目前,成體干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、治療性克隆以及以干細(xì)胞為種子細(xì)胞的組織工程(Tissueengineering,TE)技術(shù)的發(fā)展,為創(chuàng)傷修復(fù)和再生醫(yī)學(xué)的研究提供了重要的線索和途徑。但是,在目前研究中合適的種子細(xì)胞應(yīng)用,尤其是自體細(xì)胞的應(yīng)用尚存在如細(xì)胞體外擴增能力低及取材困難等難題。 口腔粘膜取材相對隱蔽,且預(yù)

3、后不留瘢痕,有望成為細(xì)胞移植、基因治療和組織工程中自體成體干細(xì)胞的一個新來源。口腔粘膜干細(xì)胞的研究不僅可進(jìn)一步明確口腔粘膜的生物學(xué)特點,而且由于其自身特點,可以做為種子細(xì)胞,在自體皮膚缺損(尤其是大面積缺損)以及受損角膜等組織的修復(fù)中具有良好的應(yīng)用前景。 本研究分離培養(yǎng)口腔粘膜干細(xì)胞,并觀察口腔粘膜干細(xì)胞的生物學(xué)行為;然后應(yīng)用組織工程技術(shù),構(gòu)建TE膜片,修復(fù)組織缺損,其中包括病損皮膚及眼角膜的修復(fù)觀察。為將來口腔粘膜源性干細(xì)胞在

4、皮膚及眼角膜病損等組織的修復(fù)應(yīng)用提供一定的實驗基礎(chǔ)。實驗主要包括以下內(nèi)容: 1、口腔粘膜干細(xì)胞的分離、鑒定和生物學(xué)性狀研究,以兔口腔粘膜為試驗對象,包括口腔粘膜固有層間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性觀察,以及口腔粘膜上皮干細(xì)胞的培養(yǎng)及生物學(xué)特性觀察。 (1)口腔粘膜固有層間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性的檢測。利用貼壁篩選方法,白兔口腔粘膜固有層中篩選出具有克隆性生長的細(xì)胞,利用間充質(zhì)干細(xì)胞相對特異表面標(biāo)識物CD44

5、等加以鑒定,確定所分離細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞;然后采用低密度連續(xù)稀釋法獲得兔口腔粘膜固有層間充質(zhì)干細(xì)胞克隆,MTT方法檢測細(xì)胞的增殖,明確其生長曲線;細(xì)胞周期檢測結(jié)果顯示:約95.1%細(xì)胞處于G0/G1期;并在成軟骨、脂肪和神經(jīng)細(xì)胞特異性誘導(dǎo)培養(yǎng)體系中分別培養(yǎng),誘導(dǎo)后細(xì)胞表達(dá)軟骨細(xì)胞(Ⅱ型膠原)、神經(jīng)細(xì)胞(NSE和S100染色)和脂肪細(xì)胞(脂滴合成和油紅O染色)特異性的標(biāo)志物,提示細(xì)胞具有多向分化潛能,支持篩選的細(xì)胞克隆為成體干細(xì)胞。結(jié)果證

6、明口腔粘膜固有層中含有具有多向分化潛能的固有層間充質(zhì)干細(xì)胞,并能在大量體外擴增培養(yǎng)。 (2)口腔粘膜上皮干細(xì)胞的體外培養(yǎng)及生物學(xué)特性檢測。利用上皮干細(xì)胞對細(xì)胞外基質(zhì)的快速黏附性,對口腔粘膜上皮干細(xì)胞進(jìn)行篩選,同時利用上皮干細(xì)胞相對特異標(biāo)識物β1整合素及Ck19加以鑒定。結(jié)果表明篩選細(xì)胞在體外呈克隆性生長,流式細(xì)胞儀檢測表明上皮干細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞所占比例為90.4%;β1整合素及Ck19陽性表達(dá),顯示所篩選細(xì)胞為上皮干細(xì)胞。

7、 本部分實驗結(jié)果首次證明在口腔粘膜固有層中含有成體干細(xì)胞,具有多向分化潛能,并可在體外大量擴增;而口腔粘膜上皮干細(xì)胞可以在體外擴增。本部分獲得處于良好生長狀態(tài)的口腔粘膜干細(xì)胞,為后續(xù)試驗奠定基礎(chǔ)。 2、口腔粘膜干細(xì)胞應(yīng)用于TE膜片的構(gòu)建,其中包括3部分,分別是TE上皮膜片的構(gòu)建、TE基質(zhì)膜片的構(gòu)建、雙層TE膜片的構(gòu)建。 (1)構(gòu)建TE上皮膜片。用本實驗室設(shè)計的組織工程皮膚培養(yǎng)系統(tǒng),以口腔粘膜上皮干細(xì)胞為種子細(xì)胞,分

8、別以膠原膜及脫細(xì)胞角膜基質(zhì)為支架,體外構(gòu)建TE上皮膜片,培養(yǎng)取材,常規(guī)HE染色檢測,并同時利用CK10(上皮角化特異標(biāo)識物)、CK19及β1整合素檢測。結(jié)果顯示口腔粘膜上皮干細(xì)胞可以在膠原膜及脫細(xì)胞支架上形成無角化的上皮結(jié)構(gòu),并且底層存在上皮干細(xì)胞。表明口腔粘膜上皮干細(xì)胞可以在體外成功構(gòu)建TE上皮膜片,同時仍保留一定的上皮干細(xì)胞,可能更有利于損傷部位結(jié)構(gòu)及功能的修復(fù)。 (2)構(gòu)建TE基質(zhì)膜片。首先以固有層間充質(zhì)干細(xì)胞為種子細(xì)胞,

9、與膠原凝膠混合構(gòu)建TE基質(zhì)膜片,同時以固有層成纖維細(xì)胞為對照組;HE結(jié)果顯示,10d時固有層間充質(zhì)干細(xì)胞組在細(xì)胞數(shù)量上比對照組多,這種數(shù)量上的差異可能在創(chuàng)傷修復(fù)中將起到重要作用。 然后,以固有層間充質(zhì)干細(xì)胞為種子細(xì)胞在脫細(xì)胞角膜基質(zhì)膜片上構(gòu)建TE基質(zhì)膜片,同時以兔角膜基質(zhì)細(xì)胞為對照。HE染色觀察,并進(jìn)行掃描電鏡觀察。結(jié)果顯示固有層間充質(zhì)干細(xì)胞在材料上生長狀態(tài)良好;表明可在體外形成TE基質(zhì)膜片,為口腔粘膜固有層間充質(zhì)干細(xì)胞在缺損修

10、復(fù)中的應(yīng)用提供了可靠的實驗條件。 (3)構(gòu)建雙層TE膜片。共分為5組,包括A組:固有層間充質(zhì)干細(xì)胞和上皮干細(xì)胞;B組:固有層間充質(zhì)干細(xì)胞和上皮干細(xì)胞/上皮細(xì)胞;C組:固有層成纖維細(xì)胞和上皮干細(xì)胞;D組:固有層成纖維細(xì)胞和上皮干細(xì)胞/上皮細(xì)胞;E組:皮膚成纖維細(xì)胞和皮膚表皮細(xì)胞(對照組);以膠原凝膠為支架,構(gòu)建含兩種不同類型細(xì)胞的雙層TE膜片。通過HE染色、免疫組織化學(xué)方法對TE膜片進(jìn)行檢測,觀察構(gòu)建的異同。結(jié)果顯示利用上皮干細(xì)胞

11、可形成角化上皮,且仍有大量上皮干細(xì)胞的存在,形成基底層;混合上皮干細(xì)胞/上皮細(xì)胞,構(gòu)建的TE膜片中上皮層明顯多于其它組,且有基底層的形成及上皮干細(xì)胞的存在,可能原因在于混合組的細(xì)胞形成微環(huán)境,更適于上皮干細(xì)胞的分化增殖,同時也促進(jìn)上皮細(xì)胞的增殖。 本部分結(jié)果表明,兔口腔粘膜干細(xì)胞可以作為種子細(xì)胞,在不同支架材料上可以在體外成功構(gòu)建TE膜片,為將來應(yīng)用于缺損修復(fù)奠定一定的基礎(chǔ)。 3、口腔粘膜干細(xì)胞構(gòu)建TE膜片應(yīng)用于創(chuàng)傷修復(fù)

12、,在第2部分成功構(gòu)建TE膜片基礎(chǔ)上,選擇三種不同損傷模型(包括全層皮膚缺損、角膜潰瘍以及角膜緣干細(xì)胞缺損),對兩種不同組織,包括皮膚(角化)和角膜(無角化)進(jìn)行修復(fù),探討口腔粘膜上皮干細(xì)胞作為種子細(xì)胞,在不同種類的受損上皮組織修復(fù)中的作用;同時探討口腔粘膜固有層間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞在不同受損類型中修復(fù)真皮層及基質(zhì)層中的作用。 (1)全層皮膚缺損模型的修復(fù)。以體外構(gòu)建的雙層TE膜片修復(fù)裸鼠全層皮膚缺損,30d后取材,HE檢測。

13、結(jié)果證明由兩種口腔粘膜干細(xì)胞所構(gòu)建的TE膜片修復(fù)裸鼠的皮膚缺損,形成的皮膚結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞狀態(tài)良好,可以成功修復(fù)并有大量真皮微血管長入,具有更好的修復(fù)效果。 (2)兔角膜潰瘍模型的修復(fù)。以熒光染料PKH26標(biāo)記口腔粘膜固有層間充質(zhì)干細(xì)胞,將其接種在脫細(xì)胞角膜基質(zhì)上,構(gòu)建TE基質(zhì)膜片。術(shù)后進(jìn)行大體及HE染色觀察、熒光顯微鏡觀察。結(jié)果表明TE基質(zhì)膜片移植后,可以修復(fù)角膜潰瘍,熒光觀察結(jié)果表明固有層間充質(zhì)干細(xì)胞8周時依然存在,說明其參與

14、角膜基質(zhì)的修復(fù)重建,本實驗首次證明口腔粘膜來源的固有層間充質(zhì)干細(xì)胞可以修復(fù)角膜基質(zhì)的損傷。 (3)角膜緣干細(xì)胞缺損的修復(fù)。利用兔口腔粘膜上皮干細(xì)胞以脫細(xì)胞基質(zhì)材料為支架構(gòu)建的TE上皮膜片,進(jìn)行自體角膜干細(xì)胞缺損模型的修復(fù),術(shù)后進(jìn)行大體及HE染色觀察。結(jié)果表明可以修復(fù)角膜干細(xì)胞缺損,為角膜提供穩(wěn)定的上皮來源,阻止新生血管入侵,恢復(fù)角膜透明性,使眼表健康重建;同時表明創(chuàng)傷局部微環(huán)境是口腔粘膜上皮干細(xì)胞替代角膜干細(xì)胞,參與角膜組織修復(fù)

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