麻黃類(lèi)藥對(duì)組成規(guī)律的基礎(chǔ)研究——麻黃-甘草藥對(duì)(I).pdf

1、研究背景：
　　 本文為國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目—麻黃類(lèi)藥對(duì)組成規(guī)律的基礎(chǔ)研究的部分研究?jī)?nèi)容。該項(xiàng)目以風(fēng)寒表實(shí)證為主線，以麻黃為主藥，從張仲景經(jīng)典名方中選擇針對(duì)主證為風(fēng)寒表實(shí)證但不同兼證的麻黃湯及其類(lèi)方中的六個(gè)藥對(duì)進(jìn)行組成規(guī)律研究，探討藥味、藥量的改變與化學(xué)成分、藥理效應(yīng)、藥代動(dòng)力學(xué)和藥物代謝組學(xué)之間的相互關(guān)系;同時(shí)縱向分析六個(gè)藥對(duì)組合與風(fēng)寒表實(shí)證遣方用藥的內(nèi)在聯(lián)系，探討藥對(duì)變化的內(nèi)涵和組成規(guī)律，促進(jìn)中醫(yī)藥學(xué)遣方用藥理論的發(fā)展。

2、
　　 麻黃—甘草藥對(duì)為上述六個(gè)藥對(duì)之一，亦為《金匱要略》所載用于表寒兼皮水的甘草麻黃湯，有利水消腫之功，主治身體面目悉腫，腰以上腫甚，身微熱，口不渴，無(wú)汗，小便不利者。方中麻黃宣發(fā)衛(wèi)陽(yáng)，散表祛邪，使風(fēng)邪水氣從外而解，又可使在里之水從小便而利;甘草和調(diào)中氣、調(diào)和藥性。兩藥合用，辛甘發(fā)散以利水，健脾和中以制水。本方中麻黃12g、甘草6g，該劑量及配比在張仲景麻黃、甘草并用的方劑中最為常用，但并不是一成不變的，如在大青龍湯、麻黃杏仁

3、甘草石膏湯、越婢湯中，麻黃用12g，甘草用6g;在麻黃附子甘草湯中，麻黃用6g、而甘草為6g，甘草用量較重;在麻黃加術(shù)湯中，麻黃用9g、而甘草為3g?！安〗耘c方相應(yīng)”，麻黃—甘草藥對(duì)針對(duì)不同主治證候采用不同的配伍比例，這也是分析其配伍內(nèi)涵探討的問(wèn)題。
　　 本文運(yùn)用現(xiàn)代藥理學(xué)方法來(lái)研究麻黃和甘草藥理效應(yīng)的相互作用，定量評(píng)價(jià)藥對(duì)是否存在配伍增效或配伍減毒，尋求最佳配比;同時(shí)研究其在體外過(guò)程中發(fā)生各種物理化學(xué)反應(yīng)后主要化學(xué)成分的變化

4、，從物質(zhì)基礎(chǔ)尋找量變到質(zhì)變的根本所在;用代謝組學(xué)的方法觀察麻黃和甘草藥對(duì)配伍對(duì)生物標(biāo)志物的影響，從代謝組學(xué)層面表征該藥對(duì)的配伍內(nèi)涵。
　　 研究意義：
　　 復(fù)方臨床療效的發(fā)揮，很大程度上取決于中藥的配伍，而藥對(duì)作為中藥配伍應(yīng)用最為常見(jiàn)的形式，它構(gòu)成簡(jiǎn)單、療效確切，且具備復(fù)方基本主治功能，是中藥復(fù)方的最小組成單位，同時(shí)也是系列復(fù)方的共同點(diǎn);藥對(duì)反映復(fù)方配伍的特殊規(guī)律與內(nèi)在聯(lián)系。因此，以藥對(duì)研究為切入點(diǎn)，闡明其配伍機(jī)制，尋

5、求發(fā)揮最佳作用的配伍比例，有利于探索與發(fā)掘藥對(duì)的基本功用與功用擴(kuò)展。開(kāi)展藥對(duì)配伍規(guī)律研究，能進(jìn)一步揭示藥對(duì)配伍的客觀規(guī)律與科學(xué)內(nèi)涵，促進(jìn)中藥配伍應(yīng)用理論的進(jìn)步;能有效地指導(dǎo)臨床遣方用藥，既利于更好運(yùn)用已有的藥對(duì)，亦利于針對(duì)疾病譜的變化、病證的發(fā)展而創(chuàng)制新藥對(duì);特別是在新藥研究中以有效成分或有效部位配伍已越來(lái)越多的今天，以傳統(tǒng)配伍的普遍規(guī)律指導(dǎo)新的配伍形式，對(duì)促進(jìn)中藥新產(chǎn)品研創(chuàng)亦具有現(xiàn)實(shí)意義。
　　 研究目的：
　　 本文

6、從以下三個(gè)層面揭示麻黃—甘草藥對(duì)配伍內(nèi)涵:
　　 (1)觀察麻黃—甘草藥對(duì)不同配比的急性毒性、抗炎、利尿三個(gè)方面的藥理效應(yīng)，應(yīng)用中效原理進(jìn)行相互作用統(tǒng)計(jì)分析，定量評(píng)價(jià)麻黃和甘草主要藥理效應(yīng)的相互作用，以判斷藥物是否增效減毒。
　　 (2)對(duì)不同配比水煎液麻黃類(lèi)生物堿（麻黃堿、偽麻黃堿、去甲基麻黃堿、去甲基偽麻黃堿和甲基麻黃堿）和甘草酸、甘草苷含量進(jìn)行研究，比較不同配比對(duì)這些化學(xué)成分含量的影響，以期從物質(zhì)基礎(chǔ)的變化來(lái)闡述藥

7、理效應(yīng)變化的內(nèi)因。
　　 (3)運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)探討大鼠灌胃麻黃、甘草和麻黃—甘草藥對(duì)后對(duì)尿液中生物標(biāo)志物的影響，尋找表征這一變化過(guò)程的生物標(biāo)志物，從系統(tǒng)與整體層面探討麻黃配伍甘草的相互作用機(jī)制。
　　 研究方法：
　　 (1)主要藥理效應(yīng)變化采用小鼠半數(shù)致死量(LD50)測(cè)定來(lái)評(píng)價(jià)麻黃、甘草及麻黃—甘草藥對(duì)三個(gè)配比的急性毒性;以醋酸致小鼠毛細(xì)血管通透性增加實(shí)驗(yàn)觀察抗炎作用;以對(duì)正常大鼠的排尿量的影響來(lái)觀察利尿作

8、用，應(yīng)用calcusyn軟件或單因素方差分析(One-wayANOVA)評(píng)價(jià)麻黃和甘草的相互作用。
　　 (2)根據(jù)麻黃—甘草的相互作用關(guān)系確定兩者協(xié)同作用的最佳配比，利用該配比進(jìn)行二甲苯致小鼠耳腫脹、角叉菜膠致大鼠足腫脹、角叉菜膠致大鼠胸膜炎三個(gè)急性炎癥實(shí)驗(yàn)和大鼠棉球肉芽腫亞急性炎癥實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步明確麻黃—甘草藥對(duì)的抗炎作用;利用角叉菜膠致大鼠胸膜炎實(shí)驗(yàn)觀察麻黃—甘草藥對(duì)對(duì)胸膜炎大鼠HE染色肺組織的病理學(xué)影響;免疫組化檢測(cè)iNO

9、S和ICAM-1在肺組織的表達(dá)情況;測(cè)定胸膜炎大鼠胸腔滲出液前列腺素E2(PGE2)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)含量以及肺組織TNF-α、IL-1β和丙二醛(MDA)含量來(lái)探討抗炎機(jī)制。觀察麻黃—甘草藥對(duì)對(duì)正常大鼠尿液中PGE2的影響，探討利尿作用機(jī)制。所有均數(shù)比較用One-wayANOVA，數(shù)據(jù)由SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (3)采用氣質(zhì)—液

10、質(zhì)(GC-MS)聯(lián)用考察麻黃水煎液及麻黃—甘草藥對(duì)不同配比共煎液中麻黃類(lèi)生物堿（麻黃堿、偽麻黃堿、去甲基麻黃堿、去甲基偽麻黃堿和甲基麻黃堿）指紋圖譜峰的變化情況，所有均數(shù)比較用One-wayANOVA;采用高效液相色譜法(HPLC)考察甘草水煎液及麻黃—甘草藥對(duì)不同配比共煎液中甘草苷和甘草酸的指紋圖譜峰的變化情況;以明確不同配比對(duì)主要藥效成分的影響，均數(shù)比較采用析因設(shè)計(jì)資料的方差分析。所有數(shù)據(jù)由SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以P＜

11、0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (4)麻黃水煎液、甘草水煎液、麻黃—甘草藥對(duì)水煎液給大鼠灌胃，于第7天收集尿液，尿液離心后進(jìn)行衍生化;采用GC-MS對(duì)大鼠尿液中代謝物進(jìn)行全掃描分析。將所得的GC-MS數(shù)據(jù)進(jìn)行峰識(shí)別、峰對(duì)齊、扣除溶劑峰、雜質(zhì)峰的處理。導(dǎo)出的數(shù)據(jù)進(jìn)行峰面積歸一化處理，生成包括樣品名稱(chēng)、歸一化峰面積的二維矩陣。利用Simca-P軟件對(duì)大鼠的尿液代謝物譜進(jìn)行主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)

12、，PCA直觀觀察不同組的差異;PLS-DA進(jìn)一步考察組間的區(qū)分程度，并根據(jù)代謝物的投影重要性(VIP)評(píng)價(jià)不同物質(zhì)與分類(lèi)的相關(guān)性程度，以VIP值＞1的代謝物作為潛在生物標(biāo)志物。運(yùn)用SPSS13.0軟件對(duì)潛在生物標(biāo)志物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，選擇差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的物質(zhì)作為最終的生物標(biāo)志物。通過(guò)與空白對(duì)照組尿液的代謝物譜比較，研究麻黃水煎液、甘草水煎液和麻黃—甘草藥對(duì)(12∶6)水煎液對(duì)大鼠內(nèi)源性代謝標(biāo)志物的影響;結(jié)合現(xiàn)有的生物化學(xué)知識(shí)闡釋麻黃、甘草

13、和麻黃—甘草藥對(duì)所影響的代謝途徑。
　　 主要研究結(jié)果：
　　 (1)麻黃—甘草藥對(duì)(12∶3)、(12∶6)和(12:12)均表現(xiàn)出毒性拮抗作用，且拮抗作用與甘草用量有明顯劑量依賴(lài)關(guān)系。麻黃—甘草藥對(duì)(12∶3)配伍，當(dāng)抑制率在25％～70％，抗炎協(xié)同作用明顯，且與空白對(duì)照組比較，抗炎作用差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;抑制率高于70％時(shí)表現(xiàn)出拮抗作用。(12∶6)抗炎抑制率在25％～70％協(xié)同作用明顯，且與空白對(duì)照組比較，抗炎作用

14、差異性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(12:12)有明顯抗炎拮抗作用。麻黃—甘草藥對(duì)(12∶3)和(12∶6)，治療指數(shù)(TI)接近。
　　 (2)與模型對(duì)照組比較，麻黃—甘草藥對(duì)(12∶6)(22.4，11.2g·kg-1)2個(gè)劑量組均能抑制二甲苯所致的小鼠耳腫脹(P＜0.05);22.4g·kg-1能抑制角叉菜膠注射后5h，7h的大鼠足腫脹(P＜0.05)，11.2，5.6g·kg-1對(duì)大鼠足腫脹度沒(méi)有抑制作用(P＞0.05);22.4g·

15、kg-1能抑制大鼠棉球肉芽腫形成(P＜0.05）;麻黃—甘草藥對(duì)22.4g·kg-1能減輕角叉菜膠對(duì)肺組織的病理?yè)p傷、抑制iNOS在肺支氣管上皮細(xì)胞的表達(dá)(P＜0.05）、對(duì)ICAM-1的表達(dá)沒(méi)有顯著影響(P＞0.05);藥對(duì)能抑制角叉菜膠誘導(dǎo)的胸膜炎大鼠胸腔液滲出(P＜0.05）、抑制滲出液白細(xì)胞數(shù)量增多以及滲出液PGE2、TNF-α和IL-1β含量升高、抑制肺組織TNF-α、IL-1β和MDA含量升高（所有P＜0.05）;麻黃—甘草

16、藥對(duì)能增加正常大鼠排尿量及尿液中K+的排泄(P＜0.05）;增加尿液中PGE2排泄(P＜0.05）。
　　 (3)麻黃—甘草藥對(duì)配伍，隨著甘草用量的增加，麻黃類(lèi)生物堿（麻黃堿、偽麻黃堿、去甲基麻黃堿、去甲基偽麻黃堿和甲基麻黃堿）和甘草酸、甘草苷含量均下降;甘草用量與7個(gè)成分的含量呈負(fù)相關(guān)，麻黃—甘草藥對(duì)(12:12)各成分下降最明顯。
　　 (4)與空白對(duì)照組比較，甘草組存在差異的生物標(biāo)志物有:α-酮戊二酸、己二酸、檸檬

17、酸、氨基馬尿酸、甲基黃嘌呤、色氨酸，水平顯著下調(diào)的有:α-酮戊二酸、己二酸、檸檬酸;生物標(biāo)志水平顯著上調(diào)的有氨基馬尿酸、甲基黃嘌呤、色氨酸。麻黃組存在差異上調(diào)的生物標(biāo)志物:丙氨酸、色氨酸。麻黃—甘草藥對(duì)組與空白對(duì)照組比較，存在差異的生物標(biāo)志物有:α-酮戊二酸、己二酸、烏頭酸、檸檬酸、丙氨酸、半胱氨酸、甲基黃嘌呤、酪氨酸、色氨酸;水平顯著下調(diào)的有α-酮戊二酸、己二酸、烏頭酸、檸檬酸、半胱氨酸;顯著上調(diào)的有丙氨酸、甲基黃嘌呤、酪氨酸、色氨酸

18、。
　　 結(jié)論：
　　 麻黃—甘草藥對(duì)主要藥理效應(yīng)的相互關(guān)系與兩者配伍后主要有效成分含量的改變有相關(guān)性，合煎后主要化學(xué)成分群含量降低，主要藥理效應(yīng)會(huì)在一定范圍內(nèi)表現(xiàn)出拮抗作用;麻黃—甘草藥對(duì)配伍，在合適的劑量和配比范圍內(nèi)，能增效減毒;(12∶3)和(12∶6)協(xié)同范圍較寬，呈現(xiàn)配伍優(yōu)勢(shì)。麻黃—甘草藥對(duì)有抗炎作用，抗炎機(jī)制可能與影響炎癥介質(zhì)產(chǎn)生和抗氧化作用有關(guān);利尿作用機(jī)制與促進(jìn)尿液PGE2排泄有關(guān)。麻黃、甘草影響的代謝標(biāo)