DADS抑制CD44+人胃癌細胞AGS“干樣”特性的作用研究.pdf

1、目的:
　　腫瘤干細胞(cancer stem cells,CSCs)是腫瘤中具有自我更新能力并能產生異質性腫瘤細胞的細胞，是腫瘤持續(xù)生長的根源。研究發(fā)現(xiàn)胃癌中存在胃癌干細胞（gastric cancer stem cells,GCSCs）。本研究的目的在于利用免疫磁珠分選技術(magnetic cell sorting,MACS)分選出CD44(+)AGS細胞，并從細胞增殖、腫瘤球形成、分化、耐藥性、侵襲遷移及體內致瘤能力等方面

2、，闡明 CD44(+)AGS細胞的GCSCs樣生物學特性；探討二烯丙基二硫（diallyl disulfide, DADS）對CD44(+)AGS細胞生長的抑制作用及對細胞周期的影響，為闡明DADS抗胃癌作用提供重要實驗依據(jù)。
　　方法:
　　MACS技術分選人胃癌AGS細胞中的CD44(+)AGS細胞亞群，流式細胞術檢測分選的效率和細胞周期分布；腫瘤球形成實驗觀察CD44(+)細胞的增殖能力；免疫熒光檢測CD44(+)細胞

3、亞群的腫瘤球的分化情況；MTT實驗檢測CD44(+)和CD44(-)AGS細胞亞群對化療藥物氟尿嘧啶和依托泊苷的敏感性；采用遷移侵襲實驗鑒定CD44(+)和CD44(-)AGS細胞亞群遷移侵襲能力；裸鼠體內成瘤實驗分析兩個亞群細胞在裸鼠體內的致瘤性；MTT法觀察DADS對AGS細胞增殖的影響；流式細胞術、軟瓊脂集落形成實驗等方法，研究DADS對 CD44(+)AGS細胞的增殖、細胞周期的影響。
　　結果:
　　1.流式細胞術

4、結果表明，在AGS人胃癌細胞系中大約有2.8％的CD44(+)AGS細胞，通過免疫磁珠術分選后，CD44(+)AGS細胞的細胞中CD44陽性率高達99.9%，而CD44(-)AGS細胞的CD44(+)亞群細胞百分比只有0.3%；
　　2.腫瘤球形成實驗發(fā)現(xiàn)，分選后的CD44(+)AGS細胞接種到無血清培養(yǎng)基中，2周后即形成典型的腫瘤球，其腫瘤球形成率可達74.3%；而CD44(-)AGS細胞不具有形成腫瘤球能力；
　　3.流

5、式細胞術顯示，CD44(+)AGS細胞的增殖率為59.6%，CD44(-)AGS細胞的細胞增殖率為28.3%；免疫熒光觀察顯示，CD44(+)AGS細胞可清晰地觀察到胞膜上的綠色熒光，而CD44(-)AGS細胞只有個別細胞有弱綠色熒光，陽性表達率極低；
　　4.分化實驗顯示，腫瘤球細胞在含血清培養(yǎng)基中貼壁生長，胞質向外伸出突起，CD44熒光表達明顯減弱，遷移出的細胞包膜上無綠色熒光，在無血清培養(yǎng)基中腫瘤球細胞CD44表達明顯，細胞

6、膜上有較強綠色熒光；
　　5.耐藥實驗結果表明：倒置顯微鏡下可見，CD44(-)AGS細胞在化療藥物作用下細胞數(shù)減少明顯多于CD44(+)AGS細胞；MTT結果顯示，CD44(-)AGS細胞對化療藥物5-FU和VP-16的敏感性明顯高于CD44(+)AGS細胞；
　　6.侵襲轉移實驗結果表明，轉移及侵襲至微孔膜下層的CD44(+)AGS細胞均比CD44(-)AGS細胞多；
　　7.裸鼠成瘤實驗顯示，CD44(+)AGS

7、細胞中2×103個細胞組未成瘤，2×104個細胞組成瘤率為75%，2×105個細胞組成瘤率100%，且瘤體較大，而CD44(-)AGS細胞各組均無裸鼠成瘤；
　　8. DADS對CD44(+)AGS細胞抑制作用實驗中，軟瓊脂集落實驗顯示DADS可呈濃度依賴性抑制CD44(+)AGS細胞增殖，流式細胞儀檢測經 DADS處理后的CD44(+)AGS細胞周期阻滯于G2/M期，且呈濃度和時間依賴性。
　　結論:
　　1.CD4