microRNA干擾RORα表達(dá)對DADS誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞增殖與周期的影響.pdf

1、目的：維甲酸相關(guān)孤核受體α（Retinoid acid receptor related Orphan Receptorα，RORα）可能參與多種腫瘤的調(diào)控。二烯丙基二硫（diallyl disulfide, DADS）可誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞增殖抑制、分化與細(xì)胞周期G2/M期阻滯，其機(jī)制可能與RORα蛋白表達(dá)上調(diào)有關(guān)，但其具體機(jī)制不明，因此本研究通過microRNA干擾技術(shù)將RORα基因沉默，觀察其對DADS誘導(dǎo)的增殖抑制與周期阻滯的影響，探

2、討DADS抑制人胃癌細(xì)胞作用的分子機(jī)制。
　　方法:
　　1.根據(jù) GenBank提供的RORα基因序列設(shè)計(jì)4條 RNA干擾序列，命名為miRNA1、miRNA2、miRNA3、miRNA4，并設(shè)計(jì)1條非特異性序列作為陰性對照。合成各自的寡核苷酸鏈，退火后與 miRNA表達(dá)載體 pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR連接，轉(zhuǎn)化擴(kuò)增后測序，將含靶向RORα的miRNA的質(zhì)粒pcDNATM6.2-GW/EmGFpmiR-R

3、ORα轉(zhuǎn)染SGC7901， MGC803細(xì)胞，建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，通過Western blot驗(yàn)證miRNA-RORα對RORα表達(dá)的抑制作用；
　　2.細(xì)胞計(jì)數(shù)、MTT法和流式細(xì)胞術(shù)分析RORα表達(dá)下調(diào)對DADS誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞增殖與周期的影響。
　　結(jié)果:
　　1.重組pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR-RORα-miRNA質(zhì)粒經(jīng)單酶切與DNA測序分析證明重組載體構(gòu)建成功，熒光顯微鏡下觀察可見轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光

4、。Western blot結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染RORα-miRNA后使人胃癌SGC7901、MGC803細(xì)胞內(nèi)RORα蛋白表達(dá)均明顯降低（P<0.05）。
　　2.細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染組比較，RORα-miRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖率增加，且群體倍增時(shí)間縮短(P<0.05)，說明抑制RORα基因表達(dá)促進(jìn)了SGC7901、MGC803細(xì)胞增殖。而陰性轉(zhuǎn)染組增殖率、群體倍增時(shí)間無明顯改變（P>0.05）。DADS處理后，各組

5、細(xì)胞群體倍增時(shí)間均延長，細(xì)胞增殖被抑制，但miRNA干擾 RORα表達(dá)后的兩組細(xì)胞經(jīng)DADS處理后，其細(xì)胞群體倍增時(shí)間延長幅度明顯低于DADS處理的未轉(zhuǎn)染組(P<0.05)，說明抑制 RORα表達(dá)削弱了DADS誘導(dǎo)的增殖抑制作用。
　　3. MTT結(jié)果顯示，RORα-miRNA轉(zhuǎn)染可使SGC7901、MGC803細(xì)胞的增殖率（光吸收值）明顯高于未轉(zhuǎn)染組(P<0.05)，說明干擾 RORα表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖。而陰性轉(zhuǎn)染組增殖率無明顯

6、改變（P>0.05）。分別加入15mg·L-1、30mg·L-1 DADS24h后，RORα-miRNA3轉(zhuǎn)染的SGC7901、MGC803細(xì)胞的增殖抑制率分別為27.14％、33.48%，均明顯低于DADS處理的未轉(zhuǎn)染組36.15%、45.35%(P<0.05)，48h、72h和96h后也是一樣的結(jié)果，提示干擾RORα表達(dá)削弱了DADS的抑制增殖作用。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)，與未轉(zhuǎn)染組比較，轉(zhuǎn)染RORα-miR3后SGC790

7、1、MGC803細(xì)胞周期中G0/G1期細(xì)胞百分比明顯降低，而S期和G2/M期細(xì)胞百分比增高（P<0.05），且增殖指數(shù)也增高（P<0.05），說明干擾RORα表達(dá)后有促進(jìn)細(xì)胞增殖作用，而陰性轉(zhuǎn)染組各期百分比、增殖指數(shù)無明顯改變（P>0.05）。15mg·L-1、30mg·L-1 DADS分別處理RORα-miR3轉(zhuǎn)染組SGC7901、MGC803細(xì)胞24h后，G2/M期百分率均明顯低于DADS處理的未轉(zhuǎn)染組（P<0.05），表明干擾RO

8、Rα表達(dá)可削弱DADS對SGC7901、MGC803細(xì)胞的G2/M期阻滯作用。
　　結(jié)論:
　　1. miR-RORα表達(dá)載體(pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR-RORα)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后可明顯抑制人胃癌SGC7901、MGC803細(xì)胞中RORα表達(dá)。
　　2. microRNA抑制RORα表達(dá)后，可促進(jìn)人胃癌SGC7901、MGC803細(xì)胞增殖，并且削弱DADS的增殖抑制及G2/M期阻滯作用，說明RORα表達(dá)上